《抗體制藥par》PPT課件.ppt

1、第四章 抗體制藥,抗體？ 1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為 白蛋白、（甲種球蛋白）、（乙種球蛋白 ）、球蛋白（丙種球蛋白），并證明抗體活 性主要存在于球蛋白組分。在相當一段時間 內(nèi)丙種球蛋白稱為抗體的同義詞。,第一節(jié) 概 述,抗體？ 抗體是指能與相應特異性結(jié)合的具有免疫 功能的球蛋白（Ig）。它是機體免疫系統(tǒng)受抗 原物質(zhì)刺激后，B淋巴細胞被活化、增值和分 化為漿細胞合成和分泌的球蛋白。,第一節(jié) 概 述,抗原決定簇？ 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化 學基團，又稱表團，通常由5-7個氨基酸殘基或 5-7個多糖殘基/核苷酸組成?？乖瓫Q定蔟是T細 胞受體、B細胞受體和抗體識別結(jié)

2、合的基本單 位，他們之間的相互作用具有高度特異性。 如：菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗 原）等。,第一節(jié) 概 述,多克隆抗體？ 病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物 質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物 ，故稱多克隆抗體，會給治療和診斷帶來誤差 。,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體？ 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜 交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。他們將抗體產(chǎn)生 細胞于具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合 ，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為 純一的單克隆細胞系，此細胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和 特異性完全相同的高純度抗體。,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體？ 由一種抗原決定簇刺激機

3、體，由一個B淋巴細 胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體。 單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn) 定、可大量生產(chǎn)等特點。,第一節(jié) 概 述,以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫瘤進行定向治 療。但是，臨床應用的實踐證明，免疫導向法并沒 有成功，其障礙有： 單克隆抗體均是鼠源性抗體，應用于人體內(nèi)可產(chǎn) 生人鼠抗體，加速了排斥反應，在人體內(nèi)半衰期 只有56h，難以維持有效藥物作用靶組織時間。 完整的抗體分子，即Ig的相對分子質(zhì)量過大，難 以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。,第一節(jié) 概 述,基于上述原因，需從兩個方面對單克隆抗體 加以改造： 降低單克隆抗體的免疫原性。 降低單克隆抗體的相對分子質(zhì)量。 利用基

4、因工程技術(shù)制備出基因工程抗體，即可達到上 述目的。,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體藥的現(xiàn)狀 抗體藥的銷售額 97年99年由4.68億美元增長到13億美元 03年抗體類藥物總銷售額將會達到50億美元 250多種抗體類藥物在臨床試驗中 1/3 已進入三期臨床 1/4 已通過臨床三期試驗 美國市場上有種治療用的抗體藥物,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體藥的現(xiàn)狀 1994年，Centocor 的Reopro一種血小板表面受體的單克隆抗體片段被批準用于臨床來預防治療血栓形成 1997年批準上市的12種生物新藥中有2種是抗體藥 1998年上市的12種新藥中有6種是抗體藥 2000年又批準了Mylotarg用于治療急

5、性髓細胞白血病的抗CD33單克隆抗體 2001年已批準及預期會被批準的10多種生物新藥中，也有5種是屬于抗體類藥,第一節(jié) 概 述,抗體藥物市場穩(wěn)步增長,第一節(jié) 概 述,第一節(jié) 概 述,全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用 于臨床診斷和治療的單克隆抗體 正在進行臨床試驗的抗體公司（38家）,第一節(jié) 概 述,當前美國治療性抗體市場,第一節(jié) 概 述,當前美國治療性抗體市場,第一節(jié) 概 述,中國抗體研究現(xiàn)狀,第一節(jié) 概 述,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,一、抗原與動物免疫 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇 三、篩選陽性克隆與克隆化 四、雜交瘤細胞抗體形狀的鑒定 五、單克隆抗體的大量制備 六、單克隆

6、抗體的純化,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,設(shè)計方案： 一個B淋巴細胞-只分泌一種特異性抗體 小鼠骨髓瘤細胞-能無限增殖,雜種細胞,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備, 雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個技術(shù)關(guān)鍵 1.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性： B淋巴細胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗 體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再 進行細胞分裂，存活一點時間后便會死亡-短命 細胞,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,骨髓瘤細胞（myeloma cells）： 惡性增殖的轉(zhuǎn)化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠 分裂和存活-長命細

7、胞。 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞-沒 有抗體分泌物。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,2. 細胞融合技術(shù)：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,3. 雜交瘤細胞的篩選：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,一、抗原與動物免疫,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,1.抗原 動物體內(nèi) 抗體 特異性差、純度低產(chǎn)量低，反應不夠靈敏,2. 抗原 動物體內(nèi) 抗體 抗原不純 抗體不純 篩選單一效應B細胞 不能增殖，產(chǎn)生大量抗體,刺激,效應B,刺激,效應B,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,動物

8、免疫:,特定目標抗原,動物,脾臟中B淋巴細胞,B淋巴細胞大量繁殖,免疫,刺激,能分泌針對于該抗原的特異性抗體,目的： 在細胞融合后獲 得盡可能多的分 泌針對于該目標 抗原的特異性抗 體的雜交瘤細胞,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,常用免疫方法：,常規(guī)免疫法 “穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆” 脾內(nèi)一次性免疫法 “省時；省抗原” 短程免疫法 “省時” 體外免疫法 “操作繁瑣”,免疫途徑：,皮下注射 腹腔注射 靜脈注射,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,常規(guī)免疫法：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,脾內(nèi)免疫法：,脾內(nèi)免疫法即在麻醉條件下直接把0.10.2 ml的抗原注入脾臟進行免疫。脾內(nèi)免疫法可提 高小鼠對抗原的免疫反應，節(jié)省

9、抗原用量，細 胞抗原只需105個左右，可溶性抗原只需10g 左右。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,體外免疫法：,體外免疫法的優(yōu)點很多，所需抗原量少，一般只需幾微克，免疫期短，僅45天，干擾 因素少，已成功的制備出針對多抗原的單克 隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞株不夠 穩(wěn)定。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇,細胞融合方法：,病毒介導的細胞融合 PEG 介導細胞融合 電極融合,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,細胞懸液的制備與融合, 脾細胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天 制備 骨髓瘤細胞懸液的制備： 于對數(shù)生長期制備 細胞融合：5% PEG （10004000），pH8.0

10、， 38， 1min,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,2. HAT培養(yǎng)基的篩選,融合后細胞混合液,HAT培養(yǎng)基,HT培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)基,2 weeks later,1 week later,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,三、篩選陽性克隆與克隆化,常用方法：,要求： 簡便、快速、敏感； 在短時間能檢測大量樣品,酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence， IFA） 放射免疫法（radioimmunoassay， RIA） 雙向擴散法,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,酶聯(lián)免疫吸附法

11、（ELISA）,技術(shù)原理：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,四、克隆化,常用克隆化方法：,有限稀釋法 軟瓊脂平板法 顯微操作法,80 個細/96孔 飼養(yǎng)細胞（feeder cells）,ELISA 法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清， 選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為 單克隆抗體。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）,由單一克隆的雜交瘤細胞分泌的抗體，只針對于一個 抗原決定簇-單克隆抗體（monoclonal antibody， MAb）,單克隆抗體優(yōu)點：,高度純一 高度專一,應用：,疾病的論斷和治療（生物導彈） 生物大分子的鑒定、定位和分離純化 細胞器的鑒定、定位和分離 特定細胞或病毒的鑒定、定位很分離,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,五、單克隆抗體的大量制備,常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：,動物接種法 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法 細胞培養(yǎng)罐法,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,五、單克隆抗體的大量制備,大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種：,體外培養(yǎng)法：10g/ml 動物體內(nèi)誘生法：520mg/ml,BALB/c小鼠 優(yōu)點：操作簡便，比較經(jīng)濟，所得單克隆抗體較多且效價較高。缺點：混有雜蛋白,有血清培養(yǎng)法； 無血清培養(yǎng)法,第二節(jié) 單克隆抗體及其