第十章酶在食品分析中的應(yīng)用ppt課件

1、第10章 酶在食品分析中的應(yīng)用,主要內(nèi)容： 1 酶法分析的特點(diǎn)及應(yīng)用類(lèi)型 2 酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA） 3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 4 酶生物傳感器 5 酶抑制率法,酶法分析的發(fā)展,酶在定量分析中的應(yīng)用可以追溯到19世紀(jì)中期。當(dāng)時(shí)，曾采用麥芽提取物作為過(guò)氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測(cè)定過(guò)氧化氫。 然而，酶法分析真正的發(fā)展應(yīng)歸于它在臨床實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用。,酶法分析的發(fā)展,如早在1914年臨床上就開(kāi)始采用脲酶測(cè)定尿中的尿素，但是在臨床實(shí)驗(yàn)室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個(gè)有效手段。 到了20世紀(jì)50年代前已有60種物質(zhì)能借助于酶法

2、分析。近年來(lái)，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、食品、環(huán)境等生物及其它樣品的檢測(cè)。,1. 酶法分析的特點(diǎn)及應(yīng)用類(lèi)型,酶的特性,酶法檢測(cè)的特點(diǎn),催化效率高,專(zhuān)一性,靈敏性強(qiáng),快速,特異性、準(zhǔn)確,不需要物理分離，干擾少,酶在食品分析中的應(yīng)用類(lèi)型,1）去除樣品中的雜質(zhì)。如測(cè)定果糖、多糖等。 2）催化待測(cè)物生成新的產(chǎn)物，而這種產(chǎn)物更容易被定量分析。如：淀粉的測(cè)定。 3）測(cè)定食品中酶的活性作為食品的指標(biāo)，如過(guò)氧化物酶的測(cè)定、蜂蜜中酶的測(cè)定。 4）利用酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的一些信息。如酶聯(lián)免疫法、酶電極法等。,2 酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）,酶聯(lián)免疫測(cè)定（enzyme-linked immunosorbe

3、nt assay ，ELISA）是繼放射免疫測(cè)定技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。 ELISA自上世紀(jì)70年代出現(xiàn)開(kāi)始，就因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、適用范圍寬、檢測(cè)速度快以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床和生物疾病診斷與控制等領(lǐng)域中倍受重視，成為檢驗(yàn)中最為廣泛應(yīng)用的方法之一。,2.1 ELISA的基本原理,（1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接（或建立關(guān)聯(lián)）。 （2）通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。 它將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專(zhuān)一性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，可對(duì)生物體內(nèi)各種微量有機(jī)物的含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。,重點(diǎn),ELISA試劑盒的組成,完整的ELISA試劑

4、盒包含以下各組分： （1）包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）； （3）酶作用的底物（顯色劑）； （4）陰性和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定）； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液；（含吐溫20磷酸鹽緩沖液） （7）酶反應(yīng)終止液。（常用硫酸）,必需,酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板,DNM-9602A酶標(biāo)分析儀,酶標(biāo)板,2.2 ELISA的基本類(lèi)型,隨著ELISA在生物檢測(cè)分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，逐漸演變出了幾種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法：,（5）捕獲法測(cè)IgM抗體； （6）ABS-ELISA法； （7）P

5、CR-酶聯(lián)免疫測(cè)定法； （8）斑點(diǎn)免疫酶結(jié)合試驗(yàn)。,（1）夾心法； （2）間接法； （3）競(jìng)爭(zhēng)法； （4）雙位點(diǎn)一步法；,雙抗體夾心法,此法常用于測(cè)定抗原, 將已知抗體吸附于固相載體, 加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。,（1）雙抗體夾心法,乙肝表面抗原。,間接法,此法是測(cè)定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定。,（2）間接法ELISA,競(jìng)爭(zhēng)法,此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例, 將抗原吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定

6、量特異性抗體，使固相抗原與待測(cè)抗原二者競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合；經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。,（3）競(jìng)爭(zhēng)法,黃曲霉素,2.3 ELISA測(cè)定中酶的作用,由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定具有極高的靈敏度。,（1）酶標(biāo)記的抗體或抗原的制備,酶標(biāo)記的抗體或抗原是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗體或抗原的免疫活性。 酶標(biāo)記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法兩種方法。酶結(jié)合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。,（2）常用的酶及底物,為什么辣根過(guò)氧化物酶可應(yīng)用于elisa？,為什么辣根過(guò)氧化物酶可應(yīng)用于elis

7、a？,（1）成本低 （2）熱穩(wěn)定性好 （3）顯色反應(yīng)類(lèi)型多,2.4 ELISA技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用,近年來(lái)，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡(jiǎn)單化和檢測(cè)的高靈敏性，在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重要有機(jī)物污染、生物毒素、食品添加劑和人畜共患疾病病原體的快速檢測(cè)和分析等食品安全性檢測(cè)領(lǐng)域正逐步推廣應(yīng)用。,（1）毒素檢測(cè),真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中的十幾種對(duì)人類(lèi)危害較大，它們一般同時(shí)具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。其中毒性最大、致癌能力最強(qiáng)的是黃曲霉毒素。它在自然界中分布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在一起，生長(zhǎng)在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。,自1977年抗黃曲霉素B1的單克

8、隆問(wèn)世至今，幾乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA 檢測(cè)方法均已建立。 在對(duì)黃曲霉素B1(AFT B1)的檢測(cè)中，其檢測(cè)AFT B1的線(xiàn)性范圍0.255.Og/mL，靈敏度為12.5 Pg，整個(gè)測(cè)定過(guò)程僅為4h。另外該方法也正在被廣泛地應(yīng)用于各種藻類(lèi)和貝類(lèi)毒素的檢測(cè)。,黃曲霉素B1 ELISA試劑盒,本試劑盒包括用于定量檢測(cè)黃曲霉素B-G的試劑和方法。 檢測(cè)數(shù)量：96孔（包括標(biāo)準(zhǔn)） 檢測(cè)時(shí)間：20分鐘,金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè),蘑菇罐頭約占我國(guó)罐頭出口量的30，中國(guó)蘑菇罐頭一度占據(jù)美國(guó)市場(chǎng)2/3份額，1989年以來(lái)FDA以我國(guó)蘑菇罐

9、頭食品含有金黃色葡萄球菌腸毒素并導(dǎo)致消費(fèi)者傷害為由，對(duì)中國(guó)蘑菇罐頭采取”自動(dòng)扣留措施”。2002年才得以解決。 FDA檢測(cè)蘑菇罐頭葡萄球菌腸毒素使用的TECRA試劑盒在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的非特異反應(yīng)，因此，這種試劑盒是不可靠的，其所得出的檢測(cè)結(jié)果也是不可靠的。,（2）農(nóng)藥殘留檢測(cè),酶聯(lián)免疫測(cè)定已成為許多國(guó)際權(quán)威分析機(jī)構(gòu)如AOAC分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止，應(yīng)用酶聯(lián)免疫測(cè)定檢測(cè)食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07g/mL，與色譜法測(cè)定的結(jié)果一致。,從目前來(lái)看，盡管ELISA檢測(cè)限度還不能完全達(dá)到國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家技術(shù)法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，而且抗體制

10、備不易和不能同時(shí)完成多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)等缺點(diǎn)，但是由于該技術(shù)具有樣本前處理簡(jiǎn)單，純化步驟少，大量樣本分析時(shí)間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場(chǎng)篩選等優(yōu)點(diǎn)，使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場(chǎng)和海關(guān)配備，工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測(cè)點(diǎn)，隨時(shí)把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果杜絕在食用之前。,（3）細(xì)菌污染檢測(cè),食品中的有害細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定數(shù)目，食用后會(huì)引起各種疾病。為了有效地控制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測(cè)方法。目前有許多種方法，其中通過(guò)制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)研究最多，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。,沙門(mén)氏菌的ELISA檢測(cè),例如對(duì)沙門(mén)氏菌最低檢測(cè)量可達(dá)500CFU/g，僅需22h，比常規(guī)方法縮

11、短了34 d，與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無(wú)交叉反應(yīng)。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動(dòng)沙門(mén)氏菌檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過(guò)程的自動(dòng)化，全程耗時(shí)僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面，可以從前增菌液中吸附被檢的沙門(mén)氏菌，對(duì)于該系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，需要做的只是加樣。,李斯特氏菌的快速檢測(cè),在對(duì)李斯特氏菌的快速檢測(cè)中，利用三株針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、無(wú)害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗，以?shī)A心ELISA法，在48h內(nèi)，可從人工模擬肉中檢測(cè)下限為5CFU/g樣品。,（4）肉類(lèi)品質(zhì)檢測(cè),ELISA在肉類(lèi)食品品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測(cè)兩個(gè)方面。腸道疾病的爆

12、發(fā)和動(dòng)物性食品有很大關(guān)系，而肉食品加熱煮制不當(dāng)是引起該疾病爆發(fā)的一個(gè)主要原因。在加熱過(guò)程中一些成分的含量會(huì)降低，而一些產(chǎn)物的濃度會(huì)提高。,當(dāng)用蛋白質(zhì)做指示劑時(shí)，可制備抗體，這種抗體對(duì)單一蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專(zhuān)一性，這樣它就可以指示蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中變化。因而ELISA可作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對(duì)乳酸脫氫酶的免疫檢測(cè)。其次是對(duì)摻入異種肉的檢測(cè)，利用多克隆抗體對(duì)血清白蛋白的酶聯(lián)免疫測(cè)定法，對(duì)鮮肉進(jìn)行摻假檢測(cè)。,幾種以單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA反應(yīng)已得到應(yīng)用，可以檢測(cè)出1%2%的摻假率。目前在商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測(cè)定已可以檢測(cè)十多種動(dòng)物肉，該方法已為美國(guó)農(nóng)

13、業(yè)部使用。同時(shí)，ELISA技術(shù)也可以利用對(duì)熱穩(wěn)定的肌肉抗原來(lái)檢測(cè)加熱處理后的肉摻假情況。目前，該技術(shù)可以檢測(cè)6種家畜熟肉制品。,（5）動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè),利用ELISA技術(shù)測(cè)定動(dòng)物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入，由原樣品的復(fù)雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過(guò)程，加速了其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。特別是對(duì)豬肉、禽肉和水產(chǎn)品中重要禁用獸藥的檢測(cè)。,如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定，不僅可作為一個(gè)定性篩選過(guò)程，也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定。檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.510-9，完全達(dá)到我國(guó)農(nóng)業(yè)部目前的110-9監(jiān)督檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。ELISA法作為鹽酸克倫

14、特羅殘留量的篩選方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)，適用于大量樣品的測(cè)定，并可能成為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。,（6） 人畜共患疾病病原體檢測(cè),在禽流感病毒檢測(cè)方面，我國(guó)已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。此外，采用ELISA法可以有效檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白，該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ǒ偱２?，BSE），與人群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關(guān)。,（7） 重金屬污染檢測(cè),金屬硫蛋白遍存于自然界，細(xì)菌、植物、動(dòng)物以及人類(lèi)肌體中，是一類(lèi)對(duì)重金屬離子有很強(qiáng)親和力，含豐富的半胱氨酸（約1/3

15、），不含芳香族氨基酸和組氨酸的低分子量蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白含有大量的-SH，能與Hg、Cd、Cu、Ag等重金屬離子結(jié)合掩蔽金屬的毒性，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的金屬離子有重要的解毒作用。,生物細(xì)胞，在環(huán)境受重金屬污染（Cu、Hg、Cd、Pb、Zn與金屬離子）的情況下，可被誘導(dǎo)合成出大量的金屬硫蛋白，且在一定范圍內(nèi)成正比，是一項(xiàng)對(duì)金屬污染具特異性的指標(biāo)。用純化的金屬硫蛋白對(duì)兔進(jìn)行免疫，兔抗血清純化后并標(biāo)記辣根過(guò)氧化酶，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中重金屬污染的超微量檢測(cè)。,（8） 食物中其它成分檢測(cè),ELISA技術(shù)同時(shí)可以用于食品中其它成分的檢測(cè)，如:(1)檢測(cè)某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來(lái)自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基

16、因成分；（2）食品中營(yíng)養(yǎng)素的測(cè)定，最小檢出限可達(dá)0.05g/g；（3）通過(guò)合成不同異黃酮的羥酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于檢測(cè)食品加工過(guò)程中的酶（如磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）含量的變化等。,2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）,PCR檢測(cè)的原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）以特定的基因片段為模板，利用人工合成的一對(duì)寡聚核苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸為底物，在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)DNA模板的變性，達(dá)到基因擴(kuò)增的目的。PCR是目前轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)較為成熟的方法。,我國(guó)已應(yīng)用PCR- 酶聯(lián)免疫測(cè)定檢測(cè)技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因大豆與玉米中常

17、用外源基因的快速檢測(cè)體系，并應(yīng)用于進(jìn)出境產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)際工作中，結(jié)果表明，PCR-酶聯(lián)免疫測(cè)定法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏特異、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及其它轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。,PCR檢測(cè)的應(yīng)用,對(duì)熱處理后的熟肉樣品，要檢測(cè)出肉制品中肉的組成比較困難，但經(jīng)PCR后檢測(cè)，牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉的最小檢測(cè)量可以達(dá)到1%2 %，而且肉制品中的抗壞血酸添加劑不影響檢測(cè)結(jié)果。目前，PCR是區(qū)分雞肉和火雞肉的唯一方法。PCR也用于食品中腐敗菌、病原菌如腸道出血性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、弧菌、金黃色葡萄球菌等的檢測(cè)。,3酶生物傳感器,酶?jìng)鞲衅髦饕盟鼘?duì)生物體的催化特性，且對(duì)特定底物有反應(yīng)

18、的特異性，把這種特異性與電化學(xué)分析的迅速性和簡(jiǎn)便性結(jié)合起來(lái)，從含有多種多樣有機(jī)物的生物試樣中，有選擇地把特定物質(zhì)迅速測(cè)定出來(lái)。,酶生物傳感器的簡(jiǎn)圖,C6H12O6 + O2 C6H12O7 + H2O2,酶?jìng)鞲衅鞯膬?yōu)點(diǎn),它還具有能反復(fù)進(jìn)行，不需要通常進(jìn)行酶分析時(shí)需要的酶和顯示劑，實(shí)現(xiàn)無(wú)試劑分析，因此，發(fā)展較快，現(xiàn)已有多酶?jìng)鞲衅鳎捎迷谏a(chǎn)線(xiàn)上監(jiān)控食品加工流程、發(fā)酵工藝過(guò)程及微生物濃度的控制，又可在包裝材料上測(cè)知食品是否經(jīng)過(guò)不當(dāng)溫度的貯存，冷凍時(shí)微生物含量及貯存壽命的預(yù)警。,酶生物傳感器在食品分析中的應(yīng)用,利用酶電極進(jìn)行食品分析，已能測(cè)定多種氨基酸和一些糖類(lèi)，如：用脲酶電極法測(cè)定食品中賴(lài)氨酸含量。由固定化蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖變旋酶及葡萄糖氧化酶的復(fù)合酶膜組成的過(guò)氧化氫雙電極系統(tǒng)，可同時(shí)測(cè)定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量，具有操作簡(jiǎn)單，測(cè)定快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，儀器穩(wěn)定性好，酶膜使用壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，一次進(jìn)樣可同時(shí)測(cè)定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量，而且樣品無(wú)需特別處理。該方法適用于食品發(fā)酵液中蔗糖和葡萄糖的測(cè)定。,酶電極在食品行業(yè)中的應(yīng)用,（1）在釀酒過(guò)程中，將乙醇酶和葡萄糖氧化酶固定成酶膜，與電極連接，制成的生物傳感器可監(jiān)控葡萄糖和乙醇的濃度； （2）利用嘌呤氧化酶