第四章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶.ppt

1、第 四章 動(dòng) 植 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 產(chǎn) 酶 The production of Enzyme by Culturing of Animal or Plant Cells,概述 動(dòng)物細(xì)胞 無(wú)細(xì)胞壁，容易貼壁 對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格（血清培養(yǎng)基） 對(duì)環(huán)境敏感（pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力） 植物細(xì)胞 有細(xì)胞壁，但比微生物的細(xì)胞壁脆弱 營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單 生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，要達(dá)到高密度較困難,植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較 動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞可以用相同方式培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng) 植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感 植物

2、、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同 動(dòng)物細(xì)胞 蛋白疫苗、抗體、激素、酶（蛋白質(zhì)或多肽） 植物細(xì)胞 色素、香精、天然產(chǎn)物（小分子）、酶,本章主要內(nèi)容 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn) 植物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制,從基因到蛋白質(zhì) 有關(guān)微生物細(xì)胞中酶合成的調(diào)節(jié)理論也基本適用于動(dòng)植物細(xì)胞 動(dòng)植物細(xì)胞具有比微生物更多的調(diào)節(jié)方式 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié) 翻譯水平調(diào)節(jié) 激素、神經(jīng)調(diào)節(jié),第一節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié),基因擴(kuò)增加速酶的合成 通過(guò)增加基因的數(shù)量調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以發(fā)生在個(gè)體發(fā)育某一階段或細(xì)

3、胞分化某一過(guò)程 細(xì)胞的一種應(yīng)急方式 基因擴(kuò)增可以由選擇壓力引起 耐藥性細(xì)胞的抗藥性產(chǎn)生 例：CHO 細(xì)胞為對(duì)抗氨甲基喋呤對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制，編碼這種酶的基因急劇擴(kuò)增,第一節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié),增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成 增強(qiáng)子（modulator） 能高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列 增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄活性，可高效增強(qiáng)某些酶基因的表達(dá) 具有細(xì)胞或組織特異性，在不同細(xì)胞或組織中增強(qiáng)效果不同,抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成 抗體酶（abzyme）：催化性抗體，是具有生物催化功能的抗體分子，是人工改造的對(duì)抗體可變區(qū)賦予催化特性的特殊抗體 修飾法 在抗體與抗原結(jié)合部位引

4、進(jìn)催化基團(tuán) 誘導(dǎo)法（主要方法） 半抗原誘導(dǎo) 酶蛋白誘導(dǎo),1902年，Haberlandt首次提出分離植物單細(xì)胞并培養(yǎng)成植株的設(shè)想 植物細(xì)胞的全能性,Haberlandt,植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶種類,植物細(xì)胞結(jié)構(gòu),植物細(xì)胞的主要特點(diǎn) 體積較大：比動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞都大 細(xì)胞生長(zhǎng)速率和代謝速率低于微生物細(xì)胞，生長(zhǎng)周期長(zhǎng) 營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單 細(xì)胞生長(zhǎng)及合成次級(jí)代謝產(chǎn)物需要光照條件 對(duì)剪切力較敏感 主要用于產(chǎn)天然產(chǎn)物、色素、香精等有機(jī)物（次級(jí)代謝物,植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì) 提高目標(biāo)物的產(chǎn)率 縮短生產(chǎn)周期 木瓜蛋白酶：木瓜生長(zhǎng)期8個(gè)月，木瓜細(xì)胞培養(yǎng)約1個(gè)月 易于管理，不受自然因素控制 可以

5、提高產(chǎn)物質(zhì)量 通過(guò)嚴(yán)格的培養(yǎng)條件控制，減少植株病蟲(chóng)害和污染 缺點(diǎn) 培養(yǎng)條件要求高 光照、剪切力影響顯著 植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢 相對(duì)于微生物,植物體外培養(yǎng) 胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng),植物細(xì)胞培養(yǎng) 外植體選擇和處理 外植體（explant） 從植株取出，經(jīng)預(yù)處理后用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的植物組織片段或小塊 根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等 選擇：無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)有規(guī)則 切片：0.51 cm 消毒 70% 乙醇 5% 次氯酸鈉 / 10% 漂白粉 0.010.1% HgCl2,植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：直接分離法 直接分離法即直接從外植體中分離 機(jī)械法 將外植體搗碎，過(guò)濾或離心分離

6、細(xì)胞 質(zhì)壁未分離；細(xì)胞破碎率高，完整細(xì)胞數(shù)量少 酶解法 利用果膠酶、纖維素酶等處理外植體，分離具有代謝活性的細(xì)胞 能降解細(xì)胞壁，必須對(duì)細(xì)胞給予滲透壓保護(hù),植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：愈傷組織誘導(dǎo)法 愈傷組織（callus） 由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的團(tuán)狀不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞群體；本意是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的可幫助傷口愈合的組織 誘導(dǎo)過(guò)程 配制半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基 滅菌、植入外植體 13周后繼代培養(yǎng),植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：原生質(zhì)體再生法 一般采用酶解法分離原生質(zhì)體，使用纖維素酶和果膠酶混合物 保持溶液的高滲狀態(tài) 防止原生質(zhì)體脹裂 滲透壓穩(wěn)定劑：糖、鹽、甘露醇、山

7、梨醇等 原生質(zhì)體培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁,植物細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng) 將游離的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)按照一定的細(xì)胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般來(lái)源于愈傷組織，選擇較松散的為宜 植物細(xì)胞培養(yǎng) 產(chǎn)物分離純化 收集培養(yǎng)液，從中獲得所需的產(chǎn)物,植物細(xì)胞培養(yǎng)基 水：一般用去離子水或蒸餾水 無(wú)機(jī)成分 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co 有機(jī)成分 碳源：糖，以蔗糖最常用 氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、無(wú)機(jī)氮 維生素：主要是B族維生素和維生素C 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：生長(zhǎng)激素、細(xì)胞分裂素等（微量） 其他：肌醇、瓊脂等,常用的植物細(xì)

8、胞培養(yǎng)基 MS 培養(yǎng)基 硝酸鹽濃度較高，營(yíng)養(yǎng)成分適宜，使用范圍廣 B5 培養(yǎng)基 NH4+ 濃度較低，適用于雙子葉木本植物 White 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽濃度低，高M(jìn)g(II)、B(III)，適用于生根培養(yǎng) KM-8P 培養(yǎng)基 有機(jī)成分種類齊全，用于原生質(zhì)體培養(yǎng) 培養(yǎng)基配制 配制母液，使用時(shí)按需要稀釋,工藝條件及其控制 溫度 室溫范圍（25 oC左右） 最適產(chǎn)酶溫度和最適生長(zhǎng)溫度不同 pH 微酸性（pH 56） 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，pH一般變化不大 溶解氧 植物細(xì)胞需氧量不高，供氧不宜過(guò)量 對(duì)剪切力敏感，通風(fēng)攪拌不宜太劇烈,工藝條件及其控制 光照 光照對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成具有重要影響（植物特色） 光照

9、有時(shí)也抑制產(chǎn)物合成 添加前體 前體：處于目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì) 添加前體相對(duì)于添加了反應(yīng)的底物 刺激劑（elector） 引導(dǎo)物質(zhì)朝特定的代謝方向進(jìn)行，強(qiáng)化次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成 常用微生物細(xì)胞壁碎片和胞外酶,產(chǎn)酶實(shí)例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SOD 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1） 生物體內(nèi)清除超氧化物陰離子自由基（O2-）的重要金屬酶類 SOD 和過(guò)氧化氫酶 (catalase)、過(guò)氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的酶促反應(yīng)防御體系，從而維護(hù)生物體內(nèi)細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng),產(chǎn)酶實(shí)例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)

10、產(chǎn) SOD 大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實(shí)、飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的大蒜蒜瓣，去除外皮 先用70% 乙醇消毒 20 s，再用0.1%升汞消毒 10 min，然后無(wú)菌水漂洗3次 在無(wú)菌條件下，切成0.5 cm3 的小塊，植入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的半固體 MS 培養(yǎng)基中 25 oC，600 lux，12 h/d光照條件下培養(yǎng)18天，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每18天繼代一次,產(chǎn)酶實(shí)例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SOD 大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 將上述在半固體 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18天的愈傷組織，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入含有3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液體 MS 培養(yǎng)基中，

11、加入滅菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d光照條件下振蕩培養(yǎng)1012天，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞 無(wú)菌條件下，經(jīng)過(guò)篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的液體 MS 培養(yǎng)基中，25 oC，600 lux，12 h/d光照條件下振蕩培養(yǎng)18天 SOD 分離純化 收集細(xì)胞，破碎，用pH 7.8 磷酸鹽緩沖液提取,1907年，Harrison 開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河 從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)，蝌蚪的神經(jīng)組織存活了數(shù)周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長(zhǎng)出了神經(jīng)纖維 1950s，Earle 用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制取病

12、毒疫苗 1967年，動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)微載體開(kāi)發(fā) 1975年，雜交瘤技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞可產(chǎn)生較高價(jià)值的物質(zhì) 激素、疫苗、單克隆抗體、酶,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu),動(dòng)物細(xì)胞特性 沒(méi)有細(xì)胞壁，細(xì)胞脆弱（區(qū)別于植物和微生物） 體積比微生物細(xì)胞大幾千倍，但稍小于植物細(xì)胞 在肌體內(nèi)相互粘連，以群體形式存在 在培養(yǎng)時(shí)具有群體效應(yīng)、貼壁依賴性、接觸抑制性、功能全能性 營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜（血清培養(yǎng)基,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 主要用于生產(chǎn)蛋白質(zhì) 生長(zhǎng)緩慢 容易受污染（細(xì)菌、支原體），培養(yǎng)過(guò)程中需添加抗生素 對(duì)剪切力特別敏感（胞外缺少保護(hù)結(jié)構(gòu)） 大部分具有貼壁依賴性 貼壁培養(yǎng) 培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格高昂 細(xì)胞生命有限，一般最

13、多繼代培養(yǎng)50代即退化死亡,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 懸浮培養(yǎng) 適用于非貼壁依賴型細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、體液（血液、淋巴液）細(xì)胞 類似于微生物細(xì)胞的深層發(fā)酵，但工藝條件有較大差別 對(duì)通氣、攪拌耐受性差 對(duì)氧氣的要求較微生物低，培養(yǎng)時(shí)需通入一定比例 CO2 優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)于貼壁培養(yǎng)） 細(xì)胞在培養(yǎng)液中均勻分散，生長(zhǎng)情況良好 傳代培養(yǎng)容易，無(wú)需消化分散細(xì)胞 培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分利用率高,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 貼壁培養(yǎng) 適用于貼壁依賴型細(xì)胞 上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞 細(xì)胞在培養(yǎng)容器表面迅速鋪展并分裂 滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但比表面積小 微載體培養(yǎng)系統(tǒng) 由葡聚糖凝膠等聚合物制得的微球 兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì) 細(xì)胞

14、生長(zhǎng)環(huán)境均一,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 固定化培養(yǎng) 貼壁或非貼壁依賴型細(xì)胞均適用 吸附法 載體為多孔性顆粒，如陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒 貼壁型細(xì)胞的微載體培養(yǎng)即屬此類 包埋法 將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中 細(xì)胞不易脫落 固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞損傷程度低，可重復(fù)使用 產(chǎn)物分離容易,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程 種質(zhì)細(xì)胞 體細(xì)胞（動(dòng)物體內(nèi)組織取出） 雜交瘤細(xì)胞 基本工藝過(guò)程,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 氨基酸：各種必需氨基酸，Gln 等，作為碳源和能源利用 維生素：B族和維C，可由血清提供 無(wú)機(jī)鹽：調(diào)節(jié)滲透壓 微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供 葡萄糖：作為碳源和能源（易產(chǎn)生乳酸） 激素：胰島素、

15、生長(zhǎng)激素、氫化可的松等，可由血清提供 生長(zhǎng)因子：如表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，一般來(lái)源于血清 培養(yǎng)基配制 配制母液，使用前過(guò)濾除菌、稀釋；Gln 單獨(dú)配制，冷凍保存,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 溫度 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一般控制在 36.50.25 oC 溫度也影響 CO2 溶解度，從而影響培養(yǎng)液 pH 值 滲透壓 保持細(xì)胞內(nèi)外等滲狀態(tài)，一般700850 kPa 溶解氧 供氧不足：細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制 過(guò)量供氧：容易產(chǎn)生較多氧自由基，殺傷細(xì)胞 用混合氣代替空氣（空氣、O2、N2、CO2,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 pH 值與 CO2 濃度 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液 pH 在 7.07

16、.6 之間，以 pH 7.4 為最佳 最常用的緩沖體系為 CO2 / HCO3- 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)缺少 CO2，培養(yǎng)液中的 HCO3- 會(huì)被耗盡；CO2 保持了 HCO3- 的濃度，以提供穩(wěn)定的緩沖環(huán)境 通常 CO2 濃度維持在 210% 之間 指示劑：酚紅,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 pH 值 HEPES 緩沖體系 HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acid HEPES is a zwitterionic organic chemical buffering agent. HEPES is w

17、idely used in cell culture, largely because it is better at maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration (produced by cellular respiration) when compared to bicarbonate buffers, which are also commonly used in cell culture. HEPES is like water in that its dissociation

18、 decreases as the temperature decreases. This makes HEPES a more effective buffering agent for maintaining enzyme structure and function at low temperatures,相關(guān)問(wèn)題 為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代 傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分離、稀釋并接種到新培養(yǎng)基上繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的階段 體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說(shuō)當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng) 當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時(shí)，正常的細(xì)胞停止生長(zhǎng)，但是轉(zhuǎn)化（即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變

19、）的、對(duì)接觸抑制不敏感的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng) 如果不及時(shí)傳代，這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會(huì)逐步取代正常的細(xì)胞，導(dǎo)致正常細(xì)胞的退化,產(chǎn)酶實(shí)例 人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn) tPA Tissue plasminogen activator (abbr. tPA) is a protein involved in the breakdown of blood clots. It is a serine protease (EC 3.4.21.68) found on endothelial cells, the cells that line the blood vessels. As an enzyme, it catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin, the major enzyme responsible for clot breakdown. Because it works on the clotting system, tPA is used in clinical medicine t