植物生物學實驗10植物種子生命力的快速測定.ppt

1、實驗十、種子生命力的快速測定,南京師范大學 生命科學學院,植物生物學實驗（二,種子生命力 指種子的萌發(fā)能力。 種子生命力測定的常規(guī)方法 發(fā)芽實驗、浮力實驗,種子生命力快速測定的常用方法,BTB法,TTC法,紅墨水法,以及熒光法、紙上熒光法、電導(dǎo)率測定法、冷凍測定法等,二、知識背景,三、測定方法,BTB法 TTC法 紅墨水法 熒光法,1、BTB法原理,凡活細胞必有呼吸作用，吸收空氣中的O2，放出CO2。CO2溶于水成為H2CO3，H2CO3解離成H+和HCO3-，使得胚周圍環(huán)境的pH值降低，可用酸堿指示劑溴麝香草酚藍（BTB）來測定pH值的改變,顏色變化越明顯則表明種子活力越強。死細胞沒有呼吸作

2、用，也沒有BTB的顏色變化,BTB法試劑,0.1% BTB 溶液： 0.1g溶解于煮沸過的自來水100mL中，用濾紙濾去殘渣。溶液若呈黃色，可滴加稀氨水或NaOH溶液，使之呈現(xiàn)藍色或藍綠色，棕色試劑瓶中保存,BTB瓊脂凝膠：取1g瓊脂煎碎后加入100mL 0.1%BTB溶液中，用小火加熱并不斷攪拌。待瓊脂完全溶解后，趁熱倒在干燥潔凈的培養(yǎng)皿中，使之為一均勻的薄層，冷卻后備用,BTB法材料與設(shè)備,恒溫箱、培養(yǎng)皿、小麥或綠豆,BTB法步驟,浸種：將待測種子在30溫水中浸種24h。 倒平板：取預(yù)先加熱融化的BTB瓊脂凝膠倒入培養(yǎng)皿，靜置冷卻，使之形成凝膠薄層,顯色：取吸脹的種子，整齊地將胚向下埋于準

3、備好的BTB瓊脂凝膠培養(yǎng)皿中，間隔距離在1cm左右。然后將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中30-35培養(yǎng)1h,BTB法步驟,1h后，記數(shù)種胚附近出現(xiàn)的黃色暈圈的活種子數(shù)，計算活種子的百分率,2、TTC法原理,凡是有生命活力的細胞均具有呼吸作用，從而都有氧化還原反應(yīng)，而死細胞則無此反應(yīng),TTC（氯化三苯四氮唑）可滲入種胚的活細胞內(nèi)，并作為氫受體被輔酶（NADH2或NADPH2）上的氫還原，此時無色的TTC便轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的TTF（三苯基甲曁），并吸附在活細胞的表面，根據(jù)活細胞著色的深淺可定性的判斷種子活力的有無與大小,該方法在國際間、地區(qū)間交換種子最為常用,注意：染色部位為生活種子的胚細胞,TTC法試劑,0.

4、5%TTC溶液：0.5gTTC（酒精溶解后）定容至100ml， 棕色瓶4保存,若溶液變成紅色，表示已被氧化不能再用,TTC法材料與設(shè)備,恒溫箱、培養(yǎng)皿、玉米種子、刀片,TTC法步驟,浸種：同BTB法,顯色：取吸脹的種子適量，用刀片沿胚的中心線縱切為兩半，將每一種子的半粒置于培養(yǎng)皿中，另半粒待用。 加入適量的0.5%TTC溶液（以浸沒種子為度），置于30恒溫箱中；1h后，倒去染色液，觀察現(xiàn)象,計算活種子的百分率,將待測種子在30溫水中浸種24h,3、紅墨水法原理,活細胞的原生質(zhì)膜具有選擇透性，紅墨水中的染色成分大紅G不能進入細胞；因而胚不被紅墨水染色,死亡的種胚細胞原生質(zhì)膜喪失選擇透性，大紅G進

5、入胚細胞并染色,注意：生活種子的胚細胞不染色,紅墨水法試劑,5%紅墨水：以市購紅墨水為原液，用自來水配制成5%的紅墨水溶液,紅墨水法材料與設(shè)備,恒溫箱、培養(yǎng)皿、玉米種子、刀片,紅墨水法步驟,浸種：同BTB法,顯色：將TTC法中剩余待用的一半種子置于另1只培養(yǎng)皿中，加入適量的5%紅墨水液（以浸沒種子為度）。 15min后倒去紅墨水，用自來水沖洗多次，直至沖洗液為無色為止。觀察現(xiàn)象，判斷種子活力的有無和大小,計算活種子的百分率,將待測種子在30溫水中浸種24h,紅墨水法,活種子,死種子,4、熒光法原理,植物種子中常含有一些物質(zhì)，能在紫外線照射下產(chǎn)生熒光，如黃酮類、香豆素類、酚類等。在衰老過程中：

6、熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、成分往往發(fā)生變化，因而改變熒光的顏色?？山柚苯佑^察熒光來鑒定種子的生命力。適用于禾谷類、松柏綱等植物的種子。 細胞膜透性增加，導(dǎo)致浸種后熒光物質(zhì)外泄，可通過觀察熒光物質(zhì)的滲出情況判斷種子的生命力。適用于十字花科植物的種子,熒光法材料與儀器,玉米種子。 紫外光燈，不產(chǎn)生熒光的濾紙,熒光法步驟,隨機取20粒種子，用刀片將玉米種子沿中心線切為兩半，使其切面朝上放在濾紙上，置于紫外光燈下照射觀察。 有生命力的種子將產(chǎn)生明亮的藍色、藍紫、藍綠 色熒光。死亡種子往往呈黃色、褐色，并暗淡無光。 觀察、計數(shù)，計算活種子的百分率,熒光法,觀察孔,紫外分析儀,電源,選擇波長,思考題,1、試比較TTC法、BTB法、紅墨水法及熒光法，測定的結(jié)果是否相同? 為什么? 哪一種方法更準確？它們與種子的實際萌芽率是否一致？如若有偏差，理論上應(yīng)為偏高還是偏低？為什么,2、BTB法測定種子發(fā)芽率時，若用煮死的種子做比較，有時也發(fā)現(xiàn)在種子周圍出現(xiàn)黃色暈圈，為什么？ 3、如果用以上各方法來進行實驗觀察沒有完全成熟的種子，將會有怎樣的結(jié)果,思考題,紙上熒光法,原理： 凡有生活力的種子和已經(jīng)死