實(shí)驗(yàn)四DNA回收純化及重組體的構(gòu)建.ppt

1、a,實(shí)驗(yàn)四 DNA回收純化及重組體的構(gòu)建,a,實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?學(xué)習(xí)和掌握從PCR產(chǎn)物中回收DNA片段的方法。并了解從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段的有關(guān)技術(shù)。 本實(shí)驗(yàn)采用粘末端連接法將PCR擴(kuò)增的DNA片段插入到pBluescript KS質(zhì)粒載體中，掌握DNA重組方法。通過本實(shí)驗(yàn)了解DNA重組技術(shù)在分子生物學(xué)研究中的重要意義,a,DNA片段的純化： DNA純化的主要目的是回收得到純的目的DNA片段，去除影響DNA連接酶活性的物質(zhì)以及其它的DNA片段。純化DNA片段的方法有多種，如：電洗脫法、從低熔點(diǎn)或普通瓊脂糖凝膠中回收、玻璃珠純化、柱層析以及硅膠吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接從 PCR

2、產(chǎn)物中或瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的試劑盒，有效地加快了DNA的純化的速度,相關(guān)基礎(chǔ)知識,a,DNA重組本質(zhì)上是一個酶促生化過程，是指將外源目的基因片段通過DNA連接酶的的作用插入到質(zhì)粒載體中的過程。DNA片段只有與載體重組并轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞中才能進(jìn)行復(fù)制。通過此方法可以對單個基因的功能進(jìn)行研究。結(jié)合PCR技術(shù)還可以應(yīng)用于疾病診斷、合成具有商業(yè)意義的產(chǎn)品，如胰島素、干擾素等,DNA重組,a,因?yàn)檩d體具有能夠在特定宿主細(xì)胞中獨(dú)立自我復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)，保證插入的外源片段的復(fù)制；并且具有多個限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，用于插入外源片段，而又不破壞質(zhì)粒本身的結(jié)構(gòu)；還具有易于篩選和檢測的標(biāo)記

3、性基因，如抗藥性基因、酶基因或營養(yǎng)缺陷型等。但針對不同的研究目，選擇的擇載體也是不同的，不僅要考慮上述特性，而且還要考慮所選載體是表達(dá)載體還是非表達(dá)載體、是真核生物表達(dá)載體還是原核生物表達(dá)載體以及酶切位點(diǎn)等方面的問題,載體的選擇,a,主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。E. coli DNA 連接酶催化DNA分子連接的機(jī)理與T4噬菌體DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為三步,DNA連接酶,a,a,T4噬菌體DNA連接酶還有一種E. coli DNA連接酶沒有的特性即將兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來的功能

4、。對于這種連接反應(yīng)的機(jī)理目前還不清楚，總的來說這種連接的效率比粘性末端的連接效率要低得多，可能是因?yàn)槠侥┒薉NA分子無法形成類似粘性末端分子那樣的相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),a,Weiss單位（Weiss等,1968），是指在37oC下20分鐘內(nèi)催化1nM 32P從焦磷酸根置換到,-32P ATP所需酶量； （NEB公司，粘性末端）將1g由HindIII酶解的DNA的12堿基對粘性末端在160C條件下、30分鐘、20l反應(yīng)體系中連接50時所需酶量。 (Takara公司)在20l的反應(yīng)體系中，6g的DNA-HindIII的分解物在160C反應(yīng)30分鐘時，有90以上的DNA片段進(jìn)行連接的酶的活性為1U。 相當(dāng)

5、于 ATP-Ppi交換反應(yīng)中0.008 Weiss U,對于T4-噬菌體DNA連接酶的活性測定至少有三種以上的方法,a,連接反應(yīng)的一項(xiàng)重要參數(shù)是溫度。理論上講連接反應(yīng)的最佳溫度是37，此時連接酶的活性最高。但37時粘性末端分子形成的配對結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最適溫度即1216。 DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來確定,連接,a,粘末端連接法 若DNA插入片段與適當(dāng)?shù)妮d體存在同源粘性末端，這將是最方便的克隆途徑。同源粘性末端包括相同內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端和不同的內(nèi)切

6、酶產(chǎn)生的互補(bǔ)粘性末端。相同內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘末端連接得到的重組質(zhì)粒能夠保留接合處的限制酶切位點(diǎn)，因此可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。而不同酶產(chǎn)生的粘性末端連接得到的重組質(zhì)粒不能夠保留接合處的限制酶切位點(diǎn)，因此不可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。以上兩類粘性末端的連接方法都很重要,a,另外，當(dāng)用單酶切時，雖然產(chǎn)生了互補(bǔ)的粘性末端，但由于載體存在自連現(xiàn)象，也會降低正確插入的頻率。通過一些處理可以減少自連現(xiàn)象的發(fā)生。常用的方法是用小腸堿性磷酸酶(CIP)去掉載體5-磷酸來達(dá)到抑制DNA片段的自身環(huán)化的目的。 綜上所述，在進(jìn)行基因重組時，一般采用插入片段及載體兩端

7、具有兩個相應(yīng)的能夠產(chǎn)生粘性末端的酶進(jìn)行酶切后重組，如插入片段和載體的一端為EcoR I ，另一端為BamH I，它們都能產(chǎn)生粘性末端，不僅易于連接，而且又不能互補(bǔ)，所以能夠得到較好的重組結(jié)果,a,a,平端連接法： 待插入片段的平末端主要由兩方面來源，即由酶切后產(chǎn)生的平端和補(bǔ)平后產(chǎn)生的平端。一般由酶切產(chǎn)生的平端較易連接。但在試驗(yàn)過程中，往往會遇到插入片段和載體之間沒有互補(bǔ)的末端，這時，就需要將末端進(jìn)行“補(bǔ)平”或去除3突出端，然后再用T4噬菌體DNA連接酶連接兩個平端。不過，平端連接的效率是比較低的，一般通過提高DNA的濃度或增加連接酶的用量可提高平端的連接效率，有時也可采取在平端加上合成的接頭的

8、方法，產(chǎn)生粘性末端，也可以提高連接的效率,a,適當(dāng)?shù)牟迦肫闻c載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般采用載體：插入片段摩爾數(shù)為1：2-3的比例,載體及插入片段的量,a,實(shí)驗(yàn)材料與儀器： PCR產(chǎn)物(0.8kb，帶有BamHI、 HindIII酶切位點(diǎn)) pBluescript KS 質(zhì)粒(3.0kb) NEB 1kb 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段 BamHI、 HindIII限制酶及 10K buffer 瓊脂糖 T4 DNA ligase 及其緩沖液(Takara) TBE緩沖液(10) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上樣液(3,a,a,電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等,

9、a,實(shí)驗(yàn)方法和步驟,PCR產(chǎn)物的純化-PCR產(chǎn)物以及空載體的酶切-乙醇沉淀-電泳檢測-連接-160C過夜,a,A 從PCR產(chǎn)物中直接回收純化DNA (Promega 公司) 直接加100l純化緩沖液于1.5ml離心管，再加入30300l PCR反應(yīng)物，Vortex混合； 加入1ml樹脂輕輕Vortex 3次，每次間隔1分鐘； 進(jìn)入C步驟,DNA回收純化步驟： 回收PCR產(chǎn)物常采用兩中方法，即直接回收和從凝膠中回收，目前有許多公司出售相關(guān)的試劑盒,a,B 從瓊脂糖凝膠回收純化DNA 用瓊脂糖凝膠分離PCR片段，用UV觀察EB染色條帶； 用干凈的刀片切出所需DNA條帶，注意要在長波長（300nm）

10、UV燈下操作，并快速操作，以免損傷DNA。應(yīng)盡可能多地去除瓊脂糖凝膠，一次操作可切取多至300mg的條帶,a,將300l (300mg) 瓊脂糖條片轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。直接在70溫育直至凝膠全部溶化（一般可按公司提供的說明書進(jìn)行）； 加1ml樹脂，徹底混合20秒，但不用Vortex； 下接C步驟,a,C 純化步驟 將取出拉桿的注射器筒（3ml）裝在純化柱上，加入上述DNA與樹脂混合液，然后裝上拉桿，慢慢將混合液推進(jìn)純化柱內(nèi)； 卸下注射器筒，拔出拉桿，再將注射器筒裝上純化柱，加2ml 80%的Isopropanol, 然后裝上拉桿，慢慢推出液體以清洗柱子,a,再次卸下注射器筒，將純化柱裝在1

11、.5ml離心管上，10000g離心2 min，以干燥樹脂； 再將純化柱裝在一個新的1.5ml離心管上，加50l水或TE緩沖液，1分鐘后，10000g離心20秒，溶出DNA片段； 移去純化柱，將純化出的DNA溶液在-20下保存?zhèn)溆?a,D 說明 若向1ml樹脂中加入500bp PCR產(chǎn)物50ng至16g，其回收率可在95以上。同樣500bp，若從低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收其回收率在7090之間,a,學(xué)生PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果(4l,PCR 產(chǎn)物純化后(相當(dāng)于0.8 l原PCR產(chǎn)物,pBluescript 酶切后,PCR 純化并酶切后 (2l,a,DNA重組,本實(shí)驗(yàn)是將具有BamHI和HindIII粘性末端的

12、基因片段以及載體通過DNA連接酶連接起來,a,方法1（酶切后乙醇沉淀，適于PCR產(chǎn)物的重組）： 在滅菌的 Eppendorf 管中加入制備pBluescript KS空載體0.2-1g(針對本實(shí)驗(yàn)，取4l約800ng)，2 l 10酶切緩沖液， BamHI & HindIII酶各1l（各5單位），用無菌雙蒸水加至20l 反應(yīng)體系，于37保溫1-3h； 在另一管中加入待插入的DNA片段（純化的PCR產(chǎn)物）0.2-1g(本實(shí)驗(yàn)約為4-10l)，2l 10酶切緩沖液，HindIII 和 BamHI酶各1l（各5單位），用無菌雙蒸水加至20l 反應(yīng)體系，于3 7保溫 1-3 h,操作步驟,a,根據(jù)實(shí)驗(yàn)

13、情況而定，完畢后各取3l酶解液做電泳分析，觀察酶解是否完全）將酶解液加入2倍體積的100乙醇以及1/10體積的3M NaAC(pH=5.2)，置-20冰箱 30min。4oC，12,000rmin離心 10 min，棄上清，加入100l 70乙醇(洗滌沉淀物)，離心去上清，室溫干燥DNA 沉淀15分鐘左右，加入 10 l 水或TE緩沖液溶解DNA； 完畢后各取2l DNA做電泳分析，0.8%瓊脂糖凝膠，進(jìn)行初步定量（同時還可以觀察載體的酶切結(jié)果,a,將酶切后的 2個DNA片段（有時需要在70oC加熱15分鐘使酶失活及酚氯仿抽提），然后按載體：待插入DNA片段1：2（摩爾）混合于一管中（載體可用50-100ng，對于本實(shí)驗(yàn)約1 l載體，2 l DNA片段，根據(jù)電泳結(jié)果來判斷 ） ，加入T4 DNA連接酶緩沖液1l，最后加T4噬菌體DNA連接酶1l(5單位)，一