熒光定量PCR的原理及使用

1、.熒光定量PCR的原理及使用熒光定量PCR(FQ-PCR)是新近出現(xiàn)的一種定量PCR檢測(cè)方法。其基本特點(diǎn)是：1、用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量。2、熒光信號(hào)通過(guò)熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標(biāo)記的序列特異性熒光探針或能量信號(hào)轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，大大提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性。3、動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)連續(xù)熒光檢測(cè)，免除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無(wú)復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過(guò)程，高效、快速。下面介紹常用的幾種檢測(cè)方法：1、 雙鏈DNA內(nèi)插染料某些染料如SYBR Green 能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合，同時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。在PCR過(guò)程中SYBR Green 可與新合成的雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生的熒光信號(hào)與雙鏈DN

2、A成正比。SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。SYBR Green I

3、熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。2、 TaqMan探針技術(shù)原理TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的35外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引

4、物之間。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其53外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。5，TaqMan探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制根據(jù)其3端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和

5、TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高10C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長(zhǎng)的更容易設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明，TaqMan MGB探針對(duì)于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。 TaqMan MGB探針探針設(shè)計(jì)一般應(yīng)符合以下條件：1、探

6、針長(zhǎng)度應(yīng)在2040個(gè)堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。2、G、C堿基含量在40-60，避免單核苷酸序列的重復(fù)。3、避免與引物發(fā)生雜交或重疊。4、探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。3、 分子信標(biāo)技術(shù)分子信標(biāo)技術(shù)（molecular beacon）也是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光分子和淬滅分子，與TaqMan探針不同的是該探針5和3末端自身可形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，此時(shí)熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會(huì)產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時(shí)，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)即FRET消失，于是溶液便產(chǎn)生熒光，熒光的強(qiáng)度與溶液中

7、模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。 Ct 值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明 ,每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系 ,起始拷貝數(shù)越多 ,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,因此只要獲得未知樣品的 Ct 值 ,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1、雙鏈DNA內(nèi)插染料 常用的是SYBR Green I熒光染料，其技術(shù)原理：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈D

8、NA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。熒光染料檢測(cè)法一般主要是利用熒光染料(如SYBR Green I)與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，優(yōu)點(diǎn)是：無(wú)需另外設(shè)計(jì)熒光探針，無(wú)需特別優(yōu)化條件，簡(jiǎn)便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀。熒光染料法實(shí)質(zhì)上是常規(guī)的PCR反應(yīng)中添

9、加了熒光染料，借助染料和雙鏈DNA的結(jié)合所發(fā)出的熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)程。由于不需要設(shè)計(jì)序列特異性探針和優(yōu)化反應(yīng)條件，價(jià)格低廉，通用性強(qiáng)，而且熒光染料法可用于任何一種型號(hào)的定量PCR儀，因而同樣得到廣泛采用。在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR Green I熒光染料，SYBR熒光染料摻入DNA雙鏈后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)；當(dāng)DNA變性時(shí)SYBR Green I染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過(guò)程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，經(jīng)檢測(cè)獲得熒光的凈增量。熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。熒光染料可以在反應(yīng)末尾對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過(guò)程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點(diǎn)緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點(diǎn)，定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品的熒光值?；诋a(chǎn)物長(zhǎng)度和G/C含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)在不同的溫度點(diǎn)解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測(cè)量。對(duì)溶解曲線進(jìn)行微分可以計(jì)算出溶解峰。溶解峰可以反映反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物，因此用溶解曲線數(shù)據(jù)就可以進(jìn)行定量檢測(cè)了。將強(qiáng)毒株H2的RNA模板做10倍倍比稀釋后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，然后按下面的公式轉(zhuǎn)換成模板的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=NDV模板濃度阿氏常數(shù)(一個(gè)堿基的平均分子量NDV模板的