核酸分子雜交與應(yīng)用

1、核酸分子雜交,核酸分子雜交：來源相同或不同的DNA甚至DNA與RNA分子變性后，在合適的條件下通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交(molecular hybridization)。核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，也是臨床分子檢驗(yàn)的重要技術(shù),核酸探針的標(biāo)記,探針(probe)是指用放射性核素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的核酸片段,標(biāo)記物,放射性標(biāo)記,非放射性標(biāo)記,生物素標(biāo)記,地高辛標(biāo)記,熒光素標(biāo)記,探針的種類,DNA探針：雙鏈或單鏈DNA探針是最常用的核酸探針。長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上。DNA探針又分為： 基因組DNA探針：有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)

2、胞DNA探針，多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。 cDNA探針：以mRNA為模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補(bǔ)于mRNA的DNA鏈,探針的種類,DNA探針優(yōu)點(diǎn)： 1、一般克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖； 2、DNA探針不易降解 3、DNA的標(biāo)記方法比較成熟,探針的種類,RNA探針：可以是標(biāo)記分離的RNA，也可以是重組質(zhì)粒在RNA聚合酶作用下的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。其優(yōu)點(diǎn)是： RNA探針為單鏈，復(fù)雜性低，與靶序列雜交反應(yīng)效率極高 因不存在重復(fù)序列，因此特異性高 本底低 缺點(diǎn),探針的種類,寡核苷酸(oligo)探針：由1750mer組成的短探針。 優(yōu)點(diǎn)： 可根據(jù)需要人工合成相應(yīng)的序列； 因片段短，只

3、有一個(gè)核苷酸突變，其Tm值也有明顯變化，特別適用于點(diǎn)突變的檢測(cè) 雜交速度快特異性強(qiáng) 缺點(diǎn)：所帶標(biāo)記物少靈敏度低；片段短雜交體不穩(wěn)定,探針的標(biāo)記,切口平移法 標(biāo)記原理：是目前實(shí)驗(yàn)室是最常用的一種脫氧核糖核酸探針標(biāo)記法。利用大腸桿菌DNA聚合酶1的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標(biāo)記。 帶缺口(nick)的線狀、超螺旋及環(huán)狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板,DNase I,DNA Pol I,-32P-dNTP,標(biāo)記步驟,1、取1gDNA溶于少量無菌蒸餾水中 2、加入l10 x切口平移緩沖液，混勻 10 x切口平移緩沖液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0

4、.1mol/L MgSO4 1mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT) 500g/ml 牛血清白蛋白,標(biāo)記步驟,3、加入除標(biāo)記核苷酸外的其他三種脫氧核糖核苷酸溶液(也可以是多種標(biāo)記核苷酸)，20mmol/L溶液各1l。 以下操作要在同位素工作室中有防護(hù)措施的情況下進(jìn)行操作 4、加入100Ci(10l)標(biāo)記的核苷酸溶液。注：應(yīng)貯存在20oC冰箱中，使用前在室溫下放置1530分鐘融化。要盡量減少凍融次數(shù),標(biāo)記步驟,5、加入無菌蒸餾水，至終體積為46.5l，混勻 6、加入0.5l稀釋的DNase I溶液，混勻 7、加入1l(5U)DNA聚合酶I溶液，混勻 注：以上操作均在冰浴中進(jìn)行 8、置1416oC水浴

5、中保溫12小時(shí) 9、加入2l 0.5mol/L EDTA終止反應(yīng) 10、純化標(biāo)記的DNA探針,單鏈DNA探針的標(biāo)記,探針的標(biāo)記,隨機(jī)引物法 標(biāo)記原理：隨機(jī)引物是含有各種可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸序列雜交，起到聚合酶促反應(yīng)的引物作用。將待標(biāo)記的探針模板與隨機(jī)引物一起退火，合成標(biāo)記探針,標(biāo)記步驟,1、冰浴中，在一微量離心管內(nèi)順序加入下列溶液，并混勻 20mmol/L DTT 1l 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1l 10 x隨機(jī)引物緩沖液 1l 標(biāo)記dCTP 3l 水 1l,標(biāo)記步驟,2、取200ng雙鏈DNA溶于1l蒸餾水中，在蠟?zāi)ど吓c1l隨機(jī)引物充分混勻，

6、吸入一毛細(xì)玻璃管中，用火封嚴(yán)兩端。置沸水浴中30分鐘并迅速置冰水浴中1分鐘。將DNA轉(zhuǎn)入上述離心管中 3、加入1l(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混勻并離心，室溫反應(yīng)3小時(shí)以上,標(biāo)記步驟,4、取10l終止緩沖液，置20oC保存?zhèn)溆?終止緩沖液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5) 50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5% SDS,隨機(jī)引物標(biāo)記法特點(diǎn),1、除能進(jìn)行雙鏈DNA標(biāo)記外，也可用于單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記。當(dāng)用RNA為模板是，操作方法同上，但必須采用反轉(zhuǎn)錄酶。 2、標(biāo)記活性高，只需25ng樣品DNA，可在3小時(shí)內(nèi)使4060以上甚至90的標(biāo)記dNT

7、P摻入到探針DNA鏈上 3、操作方便,3末端標(biāo)記,末端標(biāo)記屬于部分標(biāo)記。特點(diǎn)是可得到全長(zhǎng)DNA片段，但標(biāo)記活性不高。3末端標(biāo)記法包括限制酶切和聚合酶合成兩個(gè)過程，3標(biāo)記有兩種方式,大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法,T4DNA聚合酶標(biāo)記法,大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法,標(biāo)記反應(yīng)步驟,1)在反應(yīng)管中依次加入下列試劑并混勻,DNA 1g,10 xKlenow片段緩沖液 2l,2mmol/L3種dNTP(無dATP) 1l,32PdATP 30Ci,加水至 25l,10 xKlenow片段緩沖液 2l,0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2,0.1mmol

8、/L MgSO4,1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇,500g 牛血清白蛋白,2)加入1單位Klenow聚合酶片段，室溫反應(yīng)30min,3)加入12l0.5mol/LEDTA以終止反應(yīng)。酚/氯仿抽提1次,4)Sephadex G50柱層析或乙醇沉淀法分離標(biāo)記的DNA片段,大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法,注意事項(xiàng),1)要根據(jù)不同限制酶產(chǎn)生的不同粘性末端選擇不同的標(biāo)記核苷酸,2)選擇適當(dāng)?shù)南拗泼讣?32P-dNTP,利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填充活性，可以選擇性地將DNA雙鏈之中一條鏈特異地標(biāo)記,3)此方法不能直接用于3凸出末端DNA的標(biāo)記,加入DNA聚合酶，d

9、NTP(其中一種為標(biāo)記核苷酸,AATTC,CCTAGG,T4DNA聚合酶標(biāo)記法,T4DNA聚合酶具有兩種功能，53聚合活性 和35外切活性。當(dāng)反應(yīng)體系中缺乏dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶主要表現(xiàn)為外切酶活性。利用這一特性可產(chǎn)生5凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一為標(biāo)記核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出標(biāo)記探針,標(biāo)記反應(yīng)步驟,1)在反應(yīng)管中加入下列試劑并混勻,DNA 0.20.5g,1xT4DNA聚合酶緩沖液 2l,加水至 20l,2)加入所需的限制酶，并在適當(dāng)條件下溫育,3)加入適量T4DNA聚合酶,4)當(dāng)切除了所需數(shù)量的核苷酸后，加入 1l2mmol/L四種核苷酸(其中一

10、種為標(biāo)記核苷酸)，37oC保溫一小時(shí),5)Sephadex G50柱層析或乙醇沉淀法分離標(biāo)記的DNA片段,5末端標(biāo)記,標(biāo)記原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使 ATP分子上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5OH基團(tuán)上。因此采用-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5端標(biāo)記。但核酸樣品5端必需是去磷酸的,標(biāo)記反應(yīng)步驟,1)堿性磷酸酶的預(yù)處理：堿性磷酸酶(CIP)硫酸銨懸液4oC下在Eppendorf離心管中離心1分鐘。棄上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一個(gè)月以上,2)將DNA樣品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入,10 xCIP緩沖液

11、5l,CIP緩沖液 適量,加水至 48l,置37oC30分鐘。加入第二份CIP，繼續(xù)保溫30分鐘，即可脫去5端磷酸基團(tuán)。0.01U的CIP，可脫去1pmol5磷酸基團(tuán)(1.6g4kb線性DNA的5端數(shù)相當(dāng)于1pmol,10 xCIP緩沖液 Tris.Cl(pH9.0,10mmol/L MgCl2,1mmol/L ZnCl2,10mmol/L 亞精胺,3)加入40l H2O，10l 10 xSTE，5l 10SDS。加熱至68oC，15分鐘,10 xSTE,100mmol/L Tris.Cl(pH8.0,1mol/L NaCl,10mmol/L EDTA,酚/氯仿及氯仿各抽提兩次除CIP，Sep

12、hadexG50層析脫鹽后乙醇沉淀。取脫鹽后的脫5磷酸DNA150pmol溶于少量水中，然后加入下列試劑進(jìn)行5末端標(biāo)記,加水至50ul，混勻，37oC保溫1小時(shí)。加入2ul0.5mol/LEDTAz終止反應(yīng)，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG50層析分離后得5標(biāo)記的DNA探針,32P-ATP 50pmol(150uCi,T4多核苷酸激酶 1020U,10 x激酶緩沖液 10ul,注意事項(xiàng),1)T4多核苷酸激酶對(duì)多種雜質(zhì)非常敏感，要求必需達(dá)到一定的純度；脫磷酸后要用SephadexG50層析除去小分子及離子,2)亞精胺即可促進(jìn)-32P-ATP的摻入，又能抑制核酸酶的活性,3)脫磷酸的DNA

13、樣品最好經(jīng)電泳純化以除去其中存在的低分子質(zhì)量的核酸，否則會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制目標(biāo)DNA的標(biāo)記,探針的線純化,凝膠過濾柱層析法,利用凝膠的分子篩效應(yīng)，將標(biāo)記的DNA與小分子彼此分開。因標(biāo)記的探針量很小，一般用離心柱層析法,乙醇沉淀法,核酸分子雜交的種類和方法,核酸分子雜交的基本原理：DNA分子由兩條互補(bǔ)的單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的力有三：1、兩條鏈間互補(bǔ)堿基的氫鍵；2、堿基間的堆積力(范德華力)；3、中和鏈內(nèi)的負(fù)電荷,變性：在理化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)間的氫鍵斷裂，兩條鏈解開形成單鏈的過程,變性溫度(Tm)：核酸分子熱變性時(shí)，從開始變性到變性結(jié)束，是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的，當(dāng)變性進(jìn)行到核

14、酸分子解鏈一半時(shí)的溫度，稱變性溫度，也稱融解溫度,影響變性的因素,1、堿基組成 DNA分子中GC含量越高Tm越高。在1SSC溶液中，兩者之間的關(guān)系可以用經(jīng)驗(yàn)公式表示,Tm(G+C)%0.41+69.3,其中，69.3為無GC存在時(shí)的Tm值。(G+C)%每增加1，Tm約上升0.41oC,影響變性的因素,2、溶液的離子強(qiáng)度 DNA鏈骨架上的磷酸基團(tuán)帶有較多的負(fù)電荷，它們之間的靜電相斥作用是其雙鏈的不穩(wěn)定因素之一。在無鹽的水中，DNA在室溫下就會(huì)變性，加入鹽后，正離子可以封閉磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，使DNA穩(wěn)定性增加，Tm值升高,影響變性的因素,3、pH值 pH值在59范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。在高pH值

15、下，可使堿基失去形成氫鍵的能力。當(dāng)pH大于11.3時(shí)所有氫鍵均被破壞，DNA完全變性,4、變性劑 可以干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50的甲酰胺以使Tm值降低30 oC,復(fù)性：變性核酸分子在合適的條件下重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱復(fù)性。熱變性的DNA溶液在低于Tm值25 oC的溫度下維持相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，則可使之恢復(fù)到天然的雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)。復(fù)性的速度受以下因素影響,1、DNA濃度 DNA濃度越大復(fù)性速度越快,2、DNA的分子質(zhì)量 大分子質(zhì)量的DNA擴(kuò)散速度慢，復(fù)性速度慢,3、溫度 溫度過高，有利于DNA變性而不利于復(fù)性,4、離子強(qiáng)度,5、DNA分子

16、的復(fù)雜性 DNA總量一定時(shí)，基因組越復(fù)雜，其中特定順序的拷貝數(shù)越少，互補(bǔ)順序的濃度越低，復(fù)性反應(yīng)速度越慢,分子雜交技術(shù)就是利用了核酸分子的變性與復(fù)性原理，使變性的核酸分子與檢測(cè)核酸分子在堿基互補(bǔ)的條件下形成雜交雙螺旋的過程,探針(probe)：在核酸變性實(shí)驗(yàn)中，為使雜交體與單鏈核酸分子區(qū)分開來所使用的帶有標(biāo)記的單鏈核酸分子,核酸分子雜交分類,以雜交分子分類：DNA與DNA雜交；DNA與RNA雜交；RNA與RNA雜交,以探針標(biāo)記分類,以雜交介質(zhì)分類：液相雜交與固相雜交,固相雜交：菌落雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交及基因芯片等技術(shù),液相雜交(solution h

17、ybridization)：是一種比較原始的分子雜交技術(shù)。待測(cè)分子與探針在雜交液中完成反應(yīng)，利用層析方法將雜交分子與末雜交分子分開后用液閃儀進(jìn)行計(jì)數(shù)或利用紫外吸收特性變化分析雜交結(jié)果的分子雜交類型。液相雜交又分為：RNA酶保護(hù)分析法、核酸酶S1保護(hù)分析法,RNA酶保護(hù)分析法(RPA)：利用RNase A和RNase T1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特點(diǎn)，用體外轉(zhuǎn)錄合成的放射性標(biāo)記的RNA探針與待檢mRNA 進(jìn)行液相雜交，使互補(bǔ)序列RNA探針和待測(cè)RNA形成雜交體，用RNase降解非雜交部分RNA后分析雜交結(jié)果,RNA酶保護(hù)分析法的應(yīng)用,mRNA定量,mRNA未端定位,內(nèi)含子在相

18、應(yīng)基因中的位置,RNA酶保護(hù)分析法的主要步驟,1、制備待測(cè)RNA 從細(xì)胞或組織中提取總RNA或mRNA,2、RNA探針標(biāo)記 采用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備和標(biāo)記探針,3、分子雜交：將待測(cè)樣品RNA和RNA探針在液相中雜交，雜交前將樣品和探針變性，破壞二級(jí)結(jié)構(gòu),4、RNA酶消化單鏈RNA,5、電泳分析雜交分子,核酸酶S1保護(hù)分析法(nuclease S1 protection assay)：原理與RNA酶保護(hù)分析法的原理類似，核酸酶S1能專一性地降解單鏈DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA雜交雙鏈。采用M13體系克隆和擴(kuò)增特定基因的單鏈DNA片段，在合成過程中加入核素標(biāo)記物，即可合成出高放射性的單鏈

19、DNA探針。將探針與待測(cè)RNA樣品在液相中進(jìn)行雜交，形成DNA/RNA雜交雙鏈。酶解后進(jìn)行分析,核酸酶S1保護(hù)分析法可用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子剪切位點(diǎn)分析,液相雜交的優(yōu)點(diǎn),設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便,液相雜交的缺點(diǎn),過量未雜交探針難以除去，產(chǎn)生高背景；同源與異源核酸均可形成雙螺旋結(jié)構(gòu)使得雜交結(jié)果難以分析,固相雜交：將欲分析的樣品先結(jié)合在固相支持物上，再與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交結(jié)果可用儀器或放射自顯影技術(shù)分析雜交結(jié)果,固相支持物的選擇：可用于固相支持物的種類很多。一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個(gè)特性,1、具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力；2、與核酸分子結(jié)合后不影響與探針的結(jié)合,3、與核酸分子的結(jié)合

20、穩(wěn)定牢固,4、非特異性吸附少,5、具有良好的機(jī)械性能便于操作,硝酸纖維素濾膜,優(yōu)點(diǎn)：具有較強(qiáng)的吸附單鏈DNA或RNA的能力，特別是在高鹽濃度下，其結(jié)合能力可達(dá)80100 g/ cm2。吸附的單鏈核經(jīng)真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而結(jié)合在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜具有雜交信號(hào)本底低的特點(diǎn)廣泛用于各種雜交實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：與單鏈核酸的結(jié)合能力不十分牢固，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜時(shí)(特別是在高溫下)DNA會(huì)出現(xiàn)脫膜現(xiàn)象，硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆使操作不便,尼龍膜：是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型，不同類型的膜上網(wǎng)孔大小不同。經(jīng)正電荷基團(tuán)修飾后與核酸的結(jié)合力更強(qiáng),尼龍膜與核酸的結(jié)合

21、能力為350500 g/ cm2。經(jīng)烘烤或紫外線照射后，特別是紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷的基團(tuán)相互交聯(lián)，使結(jié)合更加牢固,Southern印跡雜交,Southern 印跡雜交過程,1、DNA樣品的酶切和電泳,2、電泳膠的處理,3、DNA的轉(zhuǎn)移,4、DNA的固定,5、DNA膜的雜交,雜交過程,1、預(yù)雜交：為了減少非特異性雜交反應(yīng)，在雜交前應(yīng)進(jìn)行預(yù)雜交，將非特異性DNA位點(diǎn)封閉。常用的封閉物有兩類：其一是變性的非特異性DNA，大多采用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封閉DNA上的非特異位點(diǎn)；封閉膜上與非特異性DNA結(jié)合位點(diǎn),預(yù)雜交液的配制,6

22、SSC（1SSC為0.15mol/L NaCl和 o.o15mol/L檸檬酸,5Denhardts溶液,0.5SDS,100g/ml變性的鮭魚精子DNA,50甲酰胺(可不用,50Denhardt,聚蔗糖(Ficoll 400) 5g,聚乙烯吡咯烷酮 5g,牛血清白蛋白(組分V) 5g,加水至500ml，分裝后保存于20oC,10mg/ml鮭魚精DNA：超聲法或用注射器通過6號(hào)針頭反復(fù)抽打?qū)NA打斷。煮沸后置20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分鐘后速置冰浴中,甲酰胺：使用前用Dowex XG8混合床陰陽離子交換樹脂處理1小時(shí)，小量分裝后置70oC保存,膜的處理：將結(jié)合了DNA(或RNA)的硝

23、酸纖維素膜或尼龍膜浸泡于6SSC溶液中2分鐘，使其充分濕潤,預(yù)雜交：將濕潤的濾膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入預(yù)雜交液，盡量排除其中的氣泡后用封口機(jī)封口,溫育：將雜交袋浸入適當(dāng)溫度的恒溫水浴中(不加甲酰胺時(shí)用68oC；加入50甲酰胺時(shí)，恒溫42oC)，溫育12小時(shí)，也可延長(zhǎng)至1216小時(shí)。保溫過程中應(yīng)不斷搖動(dòng)塑料袋，以趕走蓋在濾膜表面的氣泡，否則這些氣泡將阻礙雜交液與濾膜的接觸。(如果將預(yù)雜交液加熱到適當(dāng)溫度后再加入塑料袋內(nèi)，可以減少氣泡產(chǎn)生,2、雜交：雜交反應(yīng)是單鏈核酸探針與待測(cè)核酸分子中的特異基因序列在一定的溫度下雜交復(fù)性的過程。雜交包括以下過程,1、雜交液配制：同預(yù)雜交液

24、,2、探針變性：放射性標(biāo)記的探針為雙鏈時(shí)，于100oC加熱5分鐘變性并迅速在冰水浴中將探針驟冷。單鏈探針無須變性,3、打開預(yù)雜交袋棄去預(yù)雜交液，加入雜交液及變性的探針。排除氣泡后重新封好口,4、在與預(yù)雜交相同溫度下，保溫816小時(shí),洗膜：是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從濾膜上洗去的過程，非特異性雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，在一定溫度下，非特異性雜交體解鏈而被洗掉，而特異性雜交體則保留在濾膜上。雜交體的解鏈溫度主要取決于雜交體的同源性和溶液的離子強(qiáng)度兩個(gè)要素，同源性越高離子強(qiáng)度越高，雜交體的穩(wěn)定性越高,洗膜的操作如下,1、雜交完畢，取出雜交袋，剪去一角，棄去所有的雜交液，取出膜并迅速浸泡于大量2SSC和0.5% SDS溶液中，室溫下不斷振蕩。注意不要使濾膜干燥,2、5分鐘后，將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量2SSC和0.1% SDS溶液的容器中，室溫振蕩15分鐘,3、將濾膜轉(zhuǎn)移至一盛有大量0.1SSC和0