實驗二顯微鏡油鏡的使用及細菌的簡單染色法

1、實驗二 顯微鏡油鏡的使用及 細菌的簡單染色法,一、實驗目的,1.學習并掌握普通光學顯微鏡油鏡的使用技術(shù)； 2.學習微生物制片、染色的基本技術(shù)，掌握細菌的 簡單染色法及無菌操作技術(shù)； 3.觀察細菌的基本形態(tài),二、實驗原理,1、染色原理：用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性 染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和 帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當它生 長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通 常采用堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅或孔雀綠 等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷 的物質(zhì)結(jié)合。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細 菌所帶正電荷增

2、加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等 酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復合染 料，如伊紅美藍、伊紅天青等,簡單染色法:是只用一種染料使細菌著色以 顯示其形態(tài)的染色法，簡單染 色不能辨別細菌細胞的構(gòu)造,2、顯微鏡油鏡工作原理,利用油鏡不但能增加照明度，更主要是能增加數(shù)值口 徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值口徑?jīng)Q定的。所 謂數(shù)值口徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡 口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所 得的乘積，可用下列公式表示： NA=nsin NA:數(shù)值孔徑 n:介質(zhì)折射率 ：鏡口角的半數(shù),顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與接物鏡的數(shù)值口

3、徑成正比，與光波長度成反比，因此接物鏡的數(shù)值口徑愈大，光波波長愈短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細微結(jié)構(gòu)也愈能明顯地區(qū)別出來。 能辨別兩點之間最小距離= 1/2光波長度數(shù)值口徑 = 1/2NA,三 、實驗器材,1、活材料： 培養(yǎng)18-24h的金黃色葡萄球菌(S.aureus) 和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。 2、染色液和試劑： 復紅、美蘭、二甲苯、香柏油。 3、器材： 載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡,四、實驗步驟,1、涂片： 取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾 水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂金黃色葡萄球菌，右 邊涂芽孢桿菌，做成薄的涂面，注意取菌不要太多。

4、整個過程中要注意無菌操作。（示范無菌操作技術(shù),2、干燥：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文 火烘干。 3、固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上， 通過火焰 2-3次固定（以不燙手為宜,4、染色：將固定過的涂片加復紅或美蘭染色1-2min。 5、水洗：用水洗去涂片上的染色液。 6、干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。 7、鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇?后，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將 油鏡頭浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)。 8、繪圖,9、實驗完畢后的處理,將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈： a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。 b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦

5、23次。 c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時向一個 方向擦拭。 看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，再用洗衣粉清洗,五、結(jié)果與思考題,1、油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應 注意些什么？ 2、按比例繪出你所觀察到的細菌的形態(tài)，并顯 示兩菌的排列方式,六、注意事項,1、油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體 之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般 光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物 鏡時要特別細心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標本片并使 物鏡受損。 2、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上 的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果,實驗報告的撰寫要求,實驗報告必須以實事求是、嚴肅認真的科學態(tài)度，按照指 導書的要求按時完成。實驗報告應該簡明扼要、敘述準確、數(shù) 據(jù)完整、繪圖清晰且寫實，應有討論、有分析，結(jié)論明確。一 般應包括以下一些內(nèi)容： 1 實驗項目名稱； 2 實驗目的； 3 實驗原理； 4. 實驗材料； 5 實驗步驟； 6 實驗結(jié)果與討論,簡單染色實驗步驟,涂片 干燥 固定 染色