基因工程實驗設計

1、基因工程實驗設計DNA重組分子的構建及篩選檢測 實驗原理：Bt蛋白中的Bt是蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis的縮寫。毒蛋白是其產(chǎn)生的一種伴胞晶體，有時也稱為delta-endotoxin，即學術刊物中中文所對應“delta 內毒素”?！岸尽笔侵钙鋵μ囟ǖ奈锓N有毒性，并非對所有的生物體都有毒性。而且不同的Bt菌系產(chǎn)生的毒蛋白的特異性也不同。Cry14-4是從蘇云金芽孢桿菌中獲得的一中新的殺蟲晶體蛋白樣基因，對棉鈴幼蟲有較強的殺蟲活性。實驗步驟一目的基因的獲得1. 在NCBI網(wǎng)站上查找目的基因的核心序列 1 atgtatatgg ctgaaattaa acgtttagat

2、 tattatttag gtgccttgcc ttttggtaat 61 ttttatgtag atgattgtga tactttaaaa aattttatag atagcctttt agatggtaaa121 ccttctacaa tgaataatac tcctctaaca ggtaatgtaa atgttacaaa tcaaagtgtt181 actatcttag atgatttaga ttccatagca accctaaccc cagaatatgt atatgataat241 tatttttcta atgatacaag tactgaaaaa acttatcaaa ccttatcttt t

3、gagaaagat301 gtacaaacaa cagttagtac aactgttacc catggattcc aaattggagg gaaacttgga361 gctgaagtaa aaggaagtgt aagtattcct ttcgttgcag atggtggggt tactgtaagt421 gcagaaattt ctggacaata taatttttct tcagcagata cagaaacaac aacaacttct481 caaaaattaa ttattccttc tcagtccggt aacattcgac ctggttatac aacaagggtt541 caaattatgt

4、tagcaaaaat taatattcca caaacagcag ttcatttttc tggttctatg601 tcaggaacag tacatcggga tccaatccct agtagtgtaa taggtttggt agactacgat661 ttatatgatg aagtaaggtc tctagaaaat aattgttcaa attcaacagt aggtagagat721 acaggtttag tattaaataa cgctaatcaa agtgtagatt tttcaggaag tggatttttt781 actggttcaa ttactgcatt taatttttat gt

5、aaaaatta ctgaatatcc aattaataat841 tcttcccaag aaaatataag atggtactca atagaaccaa aagtattaaa tcaatcaatt901 atacgacatc gttttccttc aaattcttct gtgaatactt gtaattgcta a2.根據(jù)所查序列運用primer 5.0進行引物設計3.確定適合引物的序列及位置,設計酶切位點及加保護堿基 上游引物：5CCCCGGGATGTATATGGCTGAAA3 Sma1 下游引物：5CGAGCTCTTAGCAATTACAAGTACC3 Sac1 所選限制性內切酶酶切序列及

6、酶切點: Sma1:CCCGGG Sac1:GAGCTC4.菌體培養(yǎng)：將獲得的蘇云金芽孢桿菌于YT液體培養(yǎng)基，于30振蕩培養(yǎng)過夜，獲得足夠的菌體。收集菌體(注意吸干多余的水分)。 輔助裂解：如果是G+菌，應先加溶菌酶100g/mL 50L。37處理1h。 運用CTAB法提取DNA。將提取的DNA用PCR擴增獲得目的片段。2 構建克隆載體質粒（pEASY-T1質粒）1. 連接T載體，轉化大腸桿菌，涂平板（LB固體培養(yǎng)基加Kan和Amp），37培養(yǎng)12-16小時后，菌檢（M13引物）。 附圖：質粒pEASY-T1圖譜 原理：很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3端加上

7、一個突出的堿基A。pEASY-T1載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一個突出的T。這樣，pEASY-T1載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體中，形成含有目的片斷的重組載體。 反應體系：T 載體，T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液10 x buffer，無菌dd Water2. 從菌檢正確的菌落上挑菌搖菌（LB液體培養(yǎng)基加Kan和Amp）12-16h后，提取質粒，送去檢測。3 表達載體的構建（pBI121質粒） 附圖：pBI121質粒圖譜 酶切體系：30C TangoTM buffer 1X Sma1 Sac11. 將目的片段確定正確的T質粒酶切，跑膠，切膠回收，獲得帶酶切位點的的目的片段，目的載體PBI121也進行酶切，跑膠，切膠回收。2. 將酶切片段和酶切后的載體連接。四目的基因的檢測與篩選1.將表達載體運用CaCl2法轉化大腸桿菌，涂平板（LB固體培養(yǎng)基加Kan），12-16h后，菌落PCR（所設計的引物）。2.從菌檢正確的菌落上挑菌搖菌（LB液體培養(yǎng)基加Kan和Amp）12-16h后，提取質粒。進行酶切驗證。將酶切驗證結果正確的菌落的質粒轉化農(nóng)桿菌，涂平板（YEB固體培養(yǎng)基+Kan+Rif），長出菌落后，菌檢（所設計的引物），將菌檢正確的菌落挑菌，搖菌，提取質粒