藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

1、6種抗生素類藥物對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)xxx（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)）摘要:研究6種抗生素藥物對(duì)大腸桿菌體外抑菌的作用。通過在瓊脂平皿上貼藥敏片，測(cè)量抑菌圈的直徑來確定抑菌作用。結(jié)果表明大腸桿菌對(duì)青霉素、頭孢他啶表現(xiàn)中度敏感，其他表現(xiàn)為高度敏感關(guān)鍵詞:抗生素；大腸桿菌；抑菌文獻(xiàn)綜述：大腸桿菌是腸桿菌科埃希菌屬中具有代表性的菌種，主要寄居在人和動(dòng)物腸道中，其特性為革蘭氏陰性，對(duì)營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上就能很好的生長(zhǎng)，并廣泛分布于水、土壤或腐敗物中。禽大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起的多種病的總稱，包括大腸桿菌性肉芽腫、腹膜炎、輸卵管炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、眼炎、卵黃性腹膜炎等疾病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重

2、。大腸桿菌病的發(fā)生，常與許多不利的外界條件密切相關(guān)。發(fā)生時(shí)具備如下特點(diǎn)： 發(fā)病率高，死亡率高，復(fù)發(fā)率高；各日齡均易感染，癥狀典型； 混合感染嚴(yán)重；傳播途徑較多：呼吸道、消化道（包括濫用藥物引起的腸道菌群失調(diào)）、垂直傳播； 治療困難。多年來，隨著抗生素的大量應(yīng)用致使大腸桿菌病的耐藥菌株越來越多，耐藥譜也越來越廣。本實(shí)驗(yàn)通過6種臨床常用抗生素對(duì)大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)臨床常用的六種抗生素對(duì)大腸桿菌的敏感性以便準(zhǔn)確有效的利用藥物進(jìn)行治療。1 藥敏實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（AST，簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)）：用于測(cè)試抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無抑制作用。常用最低抑菌濃度（MIC）表示，即體外能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的

3、最低藥物濃度。通常根據(jù)MIC結(jié)合常用劑量時(shí)體內(nèi)該藥所能達(dá)到的血藥濃度，劃定細(xì)菌對(duì)各種抗生素敏感或耐藥的界限，給出S（敏感）、I（中介）、R（耐藥）等定性的結(jié)果來分別表示實(shí)驗(yàn)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。高度敏感（s ）表示用某種藥物治療某種細(xì)菌引起的感染常用劑量就有效，或者說常規(guī)劑量達(dá)到的平均血藥濃度超過該藥對(duì)細(xì)菌的MIC 的5 倍以上；中度敏感（I ）表示用某種藥物治療某種細(xì)菌引起的感染僅在高劑量時(shí)才有效，或者說常規(guī)劑量達(dá)到的血藥濃度相當(dāng)于或略高于對(duì)細(xì)菌的MIC ; 耐藥（R ）表示藥物對(duì)某一細(xì)菌的MIC（最低抑菌濃度） 高于治療量的藥物在血液或體液內(nèi)可能達(dá)到的濃度，或細(xì)菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥的酶，無論

4、其MIC 值大小都要判定為耐藥。2 藥敏試驗(yàn)的目的 2.1 檢測(cè)病原菌對(duì)各種抗生素的敏感性，指導(dǎo)臨床合理用藥。 2.2用于流行病學(xué)調(diào)查及院內(nèi)感染的監(jiān)控，控制和預(yù)防耐藥菌株的流行。 2.3 為經(jīng)驗(yàn)用藥提供參考依據(jù)。3 藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用藥物敏感實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時(shí)應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，因?yàn)槲覀兯幟魧?shí)驗(yàn)是藥液直接和細(xì)菌接觸，而在給禽用藥的時(shí)候，必須通過機(jī)體的吸收才能使藥物達(dá)到一定的效果，所以在給禽用藥時(shí)，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會(huì)達(dá)到好的治療效果。4 抗菌藥物的選擇原則 4.1針對(duì)不同類別的細(xì)菌，應(yīng)該有選擇的進(jìn)行抗菌

5、藥物敏感試驗(yàn)。不同細(xì)菌需要測(cè)試的藥物可能有所不同。如紅霉素用于葡萄球菌的測(cè)試而不用于腸桿菌的測(cè)試。 4.2不需要對(duì)每種抗生素均進(jìn)行測(cè)試。選擇的藥物應(yīng)該為各類抗生素的代表性藥物。 4.3 NCCLS（美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)）將測(cè)試藥物根據(jù)不同細(xì)菌 分為4組。A組為首選藥物必須常規(guī)報(bào)告；B組為與A組平行的藥物，但可以選擇性報(bào)告；C組為補(bǔ)充藥物，當(dāng)對(duì)A組、B組藥物呈現(xiàn)多重耐藥時(shí)必須報(bào)告；D組為用于尿路感染測(cè)試的藥物。 4.4 每種藥物需要測(cè)試的藥物濃度各不相同，對(duì)應(yīng)的敏感或耐藥的MIC值也不相同，NCCLS在經(jīng)過認(rèn)真地驗(yàn)證后給出了相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。5 藥敏試驗(yàn)分類5.1 紙片擴(kuò)散法該法是將含有定量抗

6、菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時(shí)，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長(zhǎng)，二抑菌范圍外的菌株則可以生長(zhǎng)，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度，并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。 5.2 稀釋法稀釋法藥敏試驗(yàn)可用于定量測(cè)試抗菌藥物對(duì)某一細(xì)菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實(shí)驗(yàn)時(shí)，抗菌藥物的濃度通常經(jīng)過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測(cè)菌肉眼可見生長(zhǎng)的最低藥物濃度成為最

7、小抑菌濃度（MIC），一個(gè)特定抗菌藥物的測(cè)試濃度范圍應(yīng)該包含能夠檢測(cè)細(xì)菌的解釋性折點(diǎn)（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時(shí)也應(yīng)該包含質(zhì)控參考菌株的MIC. 5.3 瓊脂稀釋法 首先制備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。再接種待測(cè)菌株，然后是結(jié)果判讀。 5.4 肉湯稀釋法 5.5 抗生素濃度梯度法5.6 自動(dòng)化儀器法實(shí)驗(yàn)步驟1 材料1.1 材料1.1.1 試驗(yàn)藥物 青霉素、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶1.1.2 試驗(yàn)菌種 大腸桿菌1.1.3 試驗(yàn)時(shí)間 2012年6月17日2012年6月18日1.1.4 試劑與儀器 試劑：氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、純化水。儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱、

8、壓力蒸汽器、電子天平、微量加樣器、 EP管、錐形燒瓶、平皿、曲玻棒、接種棒、濾紙。2.2 方法2.2.1肉湯的制備：用料牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂2030g、蒸餾水1000mL。2.2.1.1稱量：依次稱取各種成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水融化后到入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時(shí)要迅速。2.2.1.2溶解：在燒杯中加入少于所需的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時(shí)應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，補(bǔ)足所需水分。2.2.1.3調(diào)pH值：若PH值不適宜，可用1mol/L NaOH或1mol/LHCl

9、把pH值調(diào)至所需范圍。2.2.1.4過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，如無特殊要求時(shí)可省去此步驟。2.2.1.5分裝：按照實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。2.2.1.6加棉塞：分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。2.2.1.7包扎：棉塞上包一層牛皮紙，扎緊，即可進(jìn)行滅菌。2.2.1.8滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20min。2.2.1.9擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上

10、，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過試管總長(zhǎng)度的一半為宜。2.2.1.10無菌檢驗(yàn)：滅菌后的培養(yǎng)基放入37恒溫箱中培養(yǎng)24h，以檢驗(yàn)滅菌效果，無污染方可2.2.2瓊脂培養(yǎng)基的制備：將滅菌好的瓊脂傾倒到培養(yǎng)皿中，每只滅菌培養(yǎng)皿倒入1015ml,將皿蓋蓋好。2.2.3 細(xì)菌的培養(yǎng)：2.2.3.1接種：將菌種試管與待接種的試管培養(yǎng)基依次排列，挾于左手的拇指與食指之間，用右手的中指與食指或食指與小指拔出棉塞并挾出。置試管口于酒精火焰附近；將接種環(huán)垂直插入酒精火焰中燒紅，再橫過火焰三次，然后再放入有大腸桿菌試管壁內(nèi)，于無菌的培養(yǎng)基表面待其冷卻。用接種工具取少許菌種置于另一支試管中，按一定的接種方式把菌種接種到新的培

11、養(yǎng)基上。取出接種工具，試管口和棉塞進(jìn)行火焰滅菌。重新塞上棉塞。燒死接種工具上殘留余菌，把試管和接種工具放回原處。2.2.3.2分離:在無菌的條件下，分別取一接種大腸桿菌放入盛有無無菌水的試管中，制混合菌液。在近火焰處，左手拿平板稍抬皿蓋，右手持接種環(huán)蘸取一環(huán)混合液伸入皿內(nèi)劃線。2.2.3.3培養(yǎng)：將接種的細(xì)菌培養(yǎng)基放在3237恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察。將接種分離后的大腸桿菌放在2528的恒溫箱內(nèi)，大腸桿菌培養(yǎng)24h2.2.4瓊脂擴(kuò)散紙片法 2.2.4.1在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平

12、皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再涂布均勻。） 2.2.4.2將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。

13、 2.2.4.3將平皿培養(yǎng)基置于37溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。 結(jié)果分析與討論 1 結(jié)果：種類抗生素平均直徑（mm）敏感性青霉素類青霉素17I氨芐西林19S頭孢菌素類頭孢唑啉20S頭孢曲松20S頭孢噻肟19S頭孢他啶15I藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢噻肟對(duì)大腸桿菌敏感性較好，在測(cè)定的6種藥物中有青霉素、頭孢他啶對(duì)大腸桿菌中度敏感。判定標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)參照 抗菌藥物藥效試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn) 。抑菌圈直徑小于10mm為低度敏感；抑菌圈直徑在1018mm之間為中度敏感； 抑菌圈直徑大于18 mm為高度敏感。S（敏感）、I（中介）、R（耐藥）2 討論頭孢菌素與青霉素相比具有抗菌譜較廣，耐青

14、霉素酶，療效高、毒性低，過敏反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，在抗感染治療中占有十分重要的地位。頭孢菌素已從第一代發(fā)展到第四代，其抗菌范圍和抗菌活性也不斷擴(kuò)大和增強(qiáng)。需要指出的是，代的劃分主要是根據(jù)產(chǎn)品問世年代的先后和藥理性能的不同。這種分類并不意味著第四代產(chǎn)品就比三代產(chǎn)品好，一、二代產(chǎn)品就屬于淘汰產(chǎn)品，各有不同用途。影響抗菌作用的主要因素有： 藥物透過革蘭陽性菌細(xì)胞壁或陰性菌脂蛋白外膜（即第一道穿透屏障）的難易； 對(duì)-內(nèi)酰胺酶（第二道酶水解屏障）的穩(wěn)定性； 對(duì)抗菌作用靶位PBPs的親和性。 根據(jù)這些因素，目前臨床應(yīng)用的-內(nèi)酰胺類對(duì)革蘭陽性與陰性菌的抗菌作用可以分為青霉素，易透過革蘭陽性菌胞壁粘肽層，但它們不能透過革蘭陰性菌糖蛋白磷脂外膜，因而屬窄譜的僅對(duì)革蘭陽性菌有效。 頭孢類抗生素能適度透過革蘭陽性菌的胞壁粘肽