環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌新型試劑盒研制可行性研究報告

1、環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌新型試劑盒研制可行性研究報告 李思光南昌大學一、選題的必要性1、項目所處技術領域產業(yè)政策本項目屬生物高技術領域，是國家重點支持的研究領域，項目主要針對嚴重影響人類健康的主要病原菌的檢測與診斷需要進行檢測技術的研究與試劑盒的開發(fā)，本項目的實施可產生具有自主知識產權的科研成果。本項目技術含量高，市場競爭力強，項目完成后能夠產生較好的經濟效益和社會效益，項目符合國家產業(yè)、技術政策。2、項目所處技術領域技術發(fā)展現(xiàn)狀目前的病原菌檢測方法費時、費力、準確性低，開發(fā)快速、準確、低成本的檢測技術和配套試劑是病原菌檢測工作中亟待攻克的難題。本項目針對病原菌檢測中存在的問題，采用高靈敏

2、度、高特異性的環(huán)介導等溫擴增技術開發(fā)出簡便、快速、經濟的檢測試劑。3、項目技術先進性，對相關領域技術進步的推動作用環(huán)介導等溫擴增是利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的dna聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增dna的新技術。該技術在1h內能擴增出109靶序列拷貝。lamp技術以其特異性強、靈敏度高、快速、準確和操作簡便等優(yōu)點在核酸的科學研究、疾病的診斷和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。該技術的推廣對生物學、食品科學及醫(yī)學領域中的檢測和診斷技術的進步有推動作用。4、項目目前進展情況課題組開展了大量前期研究工作，已完成了本項目所需的科研平臺建設任務，開展了嗜水單胞菌和金黃色葡萄

3、球菌的環(huán)介導等溫擴增研究，取得了階段性研究成果，這些工作為本項目的順利完成奠定了基礎。二、技術方案論述（一）項目技術關鍵點和創(chuàng)新點，項目完成時達到的技術水平1、技術關鍵（1）本項目的技術關鍵之一是引物設計。與常規(guī)pcr引物不同，環(huán)介導等溫擴增引物設計難度大，一組引物要求有6個位點與靶序列完全匹配才能夠進行擴增。目前我們已從國際基因組數(shù)據(jù)庫中下載了部分病原菌的基因組dna，并根據(jù)基因組特點采用等溫擴增軟件設計了部分引物，現(xiàn)正通過實驗確定這些引物的性能。（2）本項目的另一技術關鍵是最佳等溫擴增體系優(yōu)化。通過對引物濃度、內引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dntp濃度、bstdna聚合酶用量、mg

4、2+濃度等條件進行優(yōu)化，能夠獲得最佳實驗條件。2、創(chuàng)新點（1）既往對病原菌的檢測一般采用細菌分離培養(yǎng)鑒定法，但該方法的準確率低，所需時間長，往往延誤臨床正確的診斷和治療。近年來，人們將pcr技術用于病原菌的檢測。pcr技術雖然較傳統(tǒng)方法靈敏、快速，但需要較昂貴的儀器設備。更為重要的是，pcr方法容易產生非特異性擴增產物，造成假陽性和假陰性結果，影響對樣品的正確判斷。本項目將建立適合于食品和臨床標本大規(guī)模檢測的環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌技術。與目前的檢測方法相比，等溫擴增法具有快速、準確、靈敏的特點。而且，等溫擴增法是在恒溫下進行，只需一個簡單的恒溫裝置，不需要pcr實驗中的昂貴儀器，因而易于

5、在基層食品質量檢測部門和醫(yī)院推廣使用。（2）目前，國外已有將環(huán)介導等溫擴增技術應用于病毒dna和rna檢測的報道，但將其應用于病原菌檢測的文獻報道極少，國內基本上還未開展環(huán)介導的等溫擴增研究工作。本項目首次提出將環(huán)介導的等溫擴增技術應用于食品和臨床標本中病原菌的檢測，并對目前的等溫擴增方法提出改進策略，發(fā)展可同時檢測多種病原菌的多重等溫擴增技術，以克服當前一個等溫擴增反應只能檢測一種dna或rna的缺點。因此，本項目的實施，將開發(fā)出具有自主知識產權的病原菌檢測試劑盒。3、項目完成時達到的技術水平項目完成時，開發(fā)的多重環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌技術及其配套試劑盒達到國際先進水平。（二）項目技術

6、方案1、技術方案（1）環(huán)介導等溫擴增（lamp）和多重等溫擴增快速檢測常見病原菌方法的建立常見病原菌特異性lamp引物的設計。根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫公布的常見病原菌dna序列，采用lamp專用引物設計軟件設計特異性lamp引物（包括每類致病菌的兩個外引物、兩個內引物和兩個環(huán)引物，其中每個內引物均具有兩段能夠識別靶分子上特定位點的序列，以保證靶序列的特異性擴增。）常見病原菌基因組dna的提取。采用本實驗室建立的基因組dna快速提取技術提取致病菌dna。lamp擴增反應體系的優(yōu)化：對引物濃度、內引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dntp濃度、bstdna聚合酶用量、mg2+濃度等條件進行優(yōu)化。

7、溫育條件的優(yōu)化：在55-65之間優(yōu)化等溫擴增溫度。擴增產物的檢測：建立快速顯色法和電泳分析法兩種檢測擴增產物的方法。以上述研究結果為基礎，建立常見病原菌的環(huán)介導等溫擴增和多重環(huán)介導等溫擴增快速檢測技術。（2）常見病原菌的環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的靈敏度分析將常見病原菌目標基因克隆至pmd-18t載體，轉化后提取質粒，倍比稀釋成含目的基因拷貝數(shù)為105、104、103、102、101，以其為模板做環(huán)介導等溫擴增反應，檢測本方法的靈敏度。（3）常見病原菌的環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的特異性分析分別以病原菌和非病原菌基因組dna為模板做環(huán)介導等溫擴增反應，檢測本方法的特異性。（4）常見病原菌的環(huán)介

8、導等溫擴增快速檢測方法與國際標準方法及常規(guī)pcr擴增方法比較分析以lamp的兩個外引物做常規(guī)pcr擴增，并與lamp的擴增結果進行比較分析，進一步判斷l(xiāng)amp技術的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。（5）常見病原菌的環(huán)介導等溫擴增和多重等溫擴增快速檢測方法在食品檢測和臨床診斷中的應用研究 將本方法應用于食品檢測和臨床診斷中，分析本方法對不同樣品檢測的準確率。（6）病原菌的環(huán)介導等溫擴增和多重等溫擴增快速檢測試劑盒的研制根據(jù)本項目所建立的lamp最佳反應體系和lamp反應產物顯示方法，研制開發(fā)快速檢測病原菌的試劑盒（包括單一病原菌檢測試劑盒和多種病原菌同時檢測試劑盒）。2、工藝流程引物優(yōu)化、組合lamp反

9、應體系的建立靈敏度試驗特異性試驗反應條件優(yōu)化陰性對照陽性對照試劑盒中試同類產品比較試驗國標法比較試驗lamp方法應用于病原體檢測樣品收集核酸提取引物設計基因序列分析（三）項目技術質量指標（1）本項目建立的方法對病原菌檢測的準確率達到95%。（2）本項目建立的方法對病原菌目的基因檢測的靈敏度達到101拷貝。（3）本項目建立的方法不產生非特異性擴增產物。（4）對病原菌目的基因的等溫擴增過程在30-60分鐘內完成，顯色法檢測擴增產物在5分鐘內完成，電泳法檢測擴增產物在60分鐘內完成。（四）項目執(zhí)行過程中各階段目標2007年度第一季度：設計引物，引物合成，購買實驗菌株和有關試劑，完善實驗條件。第二季度

10、：樣品采集，病原菌dna提取。 第三季度：等溫擴增反應體系優(yōu)化，溫育條件優(yōu)化。第四季度：擴增反應產物檢測方法的建立（快速顯色法、電泳分析法）。2008年度第一季度：環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌方法操作程序確定，多重等溫擴增同時檢測多種病原菌實驗技術建立。第二季度：環(huán)介導等溫擴增和多重等溫擴增快速檢測病原菌方法的準確度分析。第三季度：環(huán)介導等溫擴增和多重等溫擴增快速檢測病原菌方法的靈敏度分析。第四季度：環(huán)介導等溫擴增和多重等溫擴增快速檢測病原菌方法與常規(guī)pcr擴增方法比較分析。2009年度第一季度：環(huán)介導等溫擴增和多重等溫擴增快速檢測病原菌方法在食品和臨床標本上的應用及效果分析。第二季度：環(huán)介導

11、等溫擴增快速檢測病原菌試劑盒和多重等溫擴增試劑盒研制。第三季度：試劑盒的應用及技術推廣。第四季度：課題總結，鑒定。（五）項目經費預算情況本項目申請科研經費5萬元。其中設備、儀器購置費1萬元；材料、樣品加工費0.5萬元；土建安裝費0.5萬元；資料、調研費0.5萬元；實驗、檢測費2萬元；鑒定費0.5萬元。三、項目實施支撐條件1、項目技術來源本項目的技術由項目申請人建立。2、項目實驗、檢測條件項目申請人所在學院生命科學學院擁有食品科學國家重點建設學科、生物化學與分子生物學省級重點學科和食品科學教育部重點實驗室。這些重點學科和重點實驗室設施完善、先進，具有進行本項目研究的實驗條件和實驗場地，為本項目的

12、完成提供了保障。項目申請人所在的江西省生物化學與分子生物學重點實驗室實驗條件先進，具有pe-9700型pcr儀，全自動dna測序儀（abi prism 3100型）、高速冷凍離心機、超速冷凍離心機、超低溫冰箱、milli-q超純水系統(tǒng)、各種規(guī)格的電泳儀、紫外分光光度計、設施先進的細菌培養(yǎng)室等儀器設備?，F(xiàn)已完成了本項目所需的科研平臺建設工作。項目申請人長期從事分子生物學研究工作，熟練掌握了分子生物學研究技術。課題組已開展了本項目的前期研究工作，目前正在進行嗜水單胞菌和金黃色葡萄球菌的環(huán)介導等溫擴增研究，基本掌握了等溫擴增專用引物設計軟件的使用和等溫擴增的操作要點，這為本項目的順利完成奠定了技術基

13、礎。3、項目申請單位人才資源情況項目申請單位南昌大學是我省唯一一所省部共建的“211”工程重點建設大學，人才資源豐富，科研力量雄厚。生命科學學院有專任教師150人，其中正副教授60人，講師28人，中高級技術人員比例2:1。4、項目組人員專業(yè)結構、職稱結構項目組科研人員7人，主要由生物化學與分子生物學專業(yè)、微生物學專業(yè)人員組成，專業(yè)結構合理。科研人員中，教授2人、副教授2人、研究生3人。其中具有博士學位的教師2人。5、項目新增投資籌集情況本項目申請科研經費5萬元。四、項目預期經濟效益1、預期市場需求病原菌的檢測是食品檢測和臨床診斷中的常規(guī)項目，食品檢測部門和醫(yī)療機構對檢測試劑的需求量巨大。等溫擴

14、增技術在病原菌的檢測工作中有很大潛力。然而，目前國外僅有將其用于病毒dna和rna檢測的研究報道，在病原菌檢測領域尚無以此技術開發(fā)的商業(yè)試劑，國內也未見這方面的研究開發(fā)報道。因此，開發(fā)病原菌的環(huán)介導的等溫擴增試劑具有廣闊的前景。2、預期盈利水平目前以傳統(tǒng)方法檢測一個樣品中的一種致病菌的收費約50元。本項目建立的檢測技術檢測一個樣品的試劑成本約8元，如果以20元銷售，可獲利潤12元。一個小型試劑生產企業(yè)一年至少可生產檢測50萬個樣品的試劑，每年獲利600萬元。因此，該技術的推廣可產生明顯的經濟效益。3、預期產業(yè)化前景本項目是針對嚴重影響人類健康的病原菌的檢測問題提出的，研究成果的實用性強，易于轉

15、化。在產品的研制工作中采用了現(xiàn)代分子生物學新技術，產品的科技含量高，生產成本低，利潤空間大。本產品的生產不需特殊大型設備，產品定型后可向中小型生化試劑生產企業(yè)轉讓，因此，本項目的產業(yè)化前景廣闊。我省具有一定生產能力的試劑生產企業(yè)經技術培訓后可生產本產品。4、項目實施風險分析課題組已開展了本項目的前期研究工作，目前正在進行嗜水單胞菌和金黃色葡萄球菌的環(huán)介導等溫擴增研究，基本掌握了等溫擴增專用引物設計軟件的使用和等溫擴增的操作要點，這為本項目的順利完成奠定了技術基礎。項目申請人所在實驗室為江西省生物化學與分子生物學重點實驗室，實驗條件先進，現(xiàn)已完成了進行本項目研究的科研平臺建設工作。因此，本項目的

16、實施基本上不存在技術風險。常規(guī)檢測病原菌的細菌培養(yǎng)分離鑒定法費時費力，近年發(fā)展起來的pcr鑒定法易產生非特異性產物，導致假陽性或假陰性結果。與常規(guī)檢測技術和pcr技術相比，環(huán)介導的等溫擴增技術具有快速、準確、靈敏、低成本等優(yōu)點。在本項目的研究中，我們還將建立一次測試能夠檢測多種致病菌的多重環(huán)介導等溫擴增新技術。該技術易于質控，適用于大批量樣品同時檢測，值得在食品病原菌普查和人體健康普查工作中推廣應用。環(huán)介導等溫擴增新技術以其明顯的優(yōu)勢將完全能夠取代目前使用的常規(guī)分析方法和pcr方法，成為病原菌檢測中的主要檢測方法。因此，本項目的成果轉化基本上不存在市場風險。五、項目預計社會效益、環(huán)境效益1、對社會發(fā)展的作用本項目的實施將開發(fā)出具有自主知識產權的病原菌檢測技術和配套試劑