最新紙片法抗菌藥物敏感實驗操作標準（精品課件）

1、紙片法抗菌藥物敏感實驗操作標準紙片法抗菌藥物敏感實驗操作標準.3 標準比濁管 用硫酸鋇比濁管(0.5麥氏比濁標準)，標定接種菌液濃度。比濁管制備方法如下:(1）。48mol/L BaCl2，(17wvBaCl22HO)05ml,加到9.5的0.18molL(036N)H2S（1/v）溶液中,制成比濁管；（2）用光徑為c的分光光度計測定光吸收來標定比濁管.0。5麥氏標準比濁管在2m波長的吸收光度應為。08-1;(）選管徑與制備菌液試管相同的螺口試管，每管分裝m;(4）將試管帽擰緊，放室溫暗處保存；（)用前,將比濁管在旋轉振蕩器上混勻。如出現(xiàn)大顆粒，應更換；（6）每個月更換比濁管或復檢比濁管的濁度

2、。 操作步驟51 制備接種菌液5.1。1 增菌法 步驟如下：（1）選瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至少5個，用接種環(huán)挑其頂部，移至ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中；(2)置35培養(yǎng)至菌液濃度達到或超過比濁管濃度（一般需2-6小時）,濃度約12108C/ml；(3）用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度,與比濁管相同?？捎霉怆姳葷?。目測比濁須在適當光照下以黑色線條為反襯。5。1。2 直接菌懸液法 步驟如下：(1）做常規(guī)藥敏試驗,可直接用過夜培養(yǎng)的菌落（必須用無選擇性培養(yǎng)基平板，如普通瓊脂培養(yǎng)基)在鹽水或肉湯中制備接種菌液。菌液濃度調至0麥氏管；（2)此法適用于在肉湯培養(yǎng)基中生長不好的細菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈

3、球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐藥試驗；（3）當用此法做復方磺胺藥的試驗時,從平板上直接挑菌落時會攜帶相當量的拮抗劑，造成敏感菌株的抑菌環(huán)內出現(xiàn)輕微的生長菌膜。2接種平板 步驟如下：(1）校正的菌液須在5分鐘內使用。用一無菌棉試子蘸取菌液并在上端管壁旋轉擠壓幾次，去掉過多的菌液;（2)用試子涂布整個瓊脂平板表面,反復涂布幾次，每次將平皿旋轉0度，保證涂布均勻。(3）將平皿蓋打開35分鐘，使培養(yǎng)基表面的水份吸收掉。然后貼藥敏紙片；(4）注意：避免用過濃的菌液,禁用未經稀釋菌或其他不標準菌液接種平板。5.3 貼紙片 (1）接種平板后，貼上藥敏紙片.用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面

4、貼牢。紙片要貼得均勻,紙片與紙片中心距離不得小于4mm。原則上,直徑0m得平板貼12張紙片,直徑10mm平板貼5張紙片。紙片貼后不應再移動,因為有些藥物會立即擴散;(2）貼上紙片5分鐘內，須把平板倒放在35恒溫箱中。因為抑菌環(huán)解釋標準是在普通環(huán)境中標定的，所以除嗜血桿菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高2的環(huán)境中。CO與某些因素作用可使抑菌環(huán)增大。5. 讀取結果（1)經1618小時培養(yǎng)后，觀察結果。菌液濃度適合且涂得好,抑菌環(huán)規(guī)則，細菌呈融合生長。如果出現(xiàn)單個菌落，說明接種量小,需重做試驗，測量抑菌環(huán)直徑須包含紙片直徑：手持平皿從背面目測檢查每塊平板,借反射光(黑色無放光背景）,用卡尺、普通尺或

5、特制的模板量取抑菌環(huán)直徑，單位為毫米。培養(yǎng)基中如果加了血液，須打開平皿蓋,借反射光，從正面量抑菌環(huán)。如果是葡萄球菌或腸球菌，須培養(yǎng)2小時后，經投射光檢查苯唑青霉素和萬古霉素的抑菌環(huán)內有無耐藥菌株的生長.抑菌環(huán)內有任何生長的表現(xiàn)都表明是耐藥菌株。（2）肉眼見不到細菌明顯生長的區(qū)域為抑菌環(huán)邊緣,有很難辨認的細小菌落不算。如抑菌環(huán)內有大量細菌生長,須再移植出來，重新鑒定，重新做藥敏試驗。變形菌在某些抗菌藥物紙片周圍可彌漫生長到抑菌的區(qū)域內,當抑菌環(huán)邊緣清楚,彌漫生長不算。甲氧芐氨嘧啶和磺胺藥的拮抗劑會支持細菌生長，因而測這類藥時可忽略輕微生長（80以上受抑制），以濃密生長的區(qū)域作為抑菌環(huán)的界限。用加

6、血的培養(yǎng)基測鏈球菌，測量抑菌環(huán)時不包括溶血環(huán).（）參照表2的標準對抑菌環(huán)的大小作出解釋，以敏感、中介或耐藥的形式解釋結果. 嬌嫩細菌 uellr-Hiton培養(yǎng)基只適用于快速生長的細菌，一般不適于測定嬌嫩細菌。嬌嫩細菌的藥敏試驗如果要用紙片法做，培養(yǎng)基、質量控制方法、解釋標準都須做修改以適合每種細菌。以下介紹的紙片方法用于流感嗜血桿菌,淋病奈瑟氏菌和肺炎鏈球菌等嬌嫩細菌,結果是準確的.其他細菌須用稀釋法測定。厭氧菌不能用紙片擴散法測定抗菌藥物敏感性。結果解釋.1 抑菌環(huán)解釋標準 抑菌環(huán)解釋標準見表、A、2B和2C。表中所列的敏感類別首先是經過將抑菌環(huán)直徑與肉湯或平板稀釋法測定的最低抑菌濃度（M

7、IC)進行比較,并且根據(jù)已知敏感和抗菌株的抑菌環(huán)或IC的群體分布得出的。然后再結合MIC與抑菌環(huán)直徑的相關分布，結合藥物常用劑量的臨床藥物代謝動力學關系進行分析。最終還要結合臨床的治療效果對體外試驗和藥理的數(shù)據(jù)做綜合評價。8。2 敏感度分級8。1敏感 表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效。禁忌癥除外.8. 中介 指MC接近藥物的血液濃度或組織液濃度療效低于敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如-內酰胺類藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液)被抑制。另外，中介還表示“緩沖域，以防止由微小的技術因素失控，所導致較大的錯誤解釋(如某菌種極少對某藥物敏感或抑菌環(huán)完全

8、不會在此測定范圍內，或培養(yǎng)基的差異影響了藥物，或藥物的中毒界限很窄）。8.2。3 耐藥 被測菌定為耐藥是指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內或血液中所達到的濃度所抑制，或屬于具有特定耐藥機理(如內酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。8。與敏感度相關的MIC分界點 抑菌環(huán)直徑與用標準方法（一般指肉湯稀釋法）測得的MI呈負相關。表2,A,2B和C列出與抑菌環(huán)敏感度分界點相關的MIC分界點.這些與抑菌環(huán)直徑相對應的MIC分界點是根據(jù)抑菌環(huán)和MIC相關性的研究，以及藥物代謝動力學和臨床療效的分析，并且與NL M7標準（Mthodsfr Diluion Antimicrobia Suptibiity e

9、ss fo Bacteria that Grw Aerobically）所定的MIC分界點相似得出的。然而，由于方法學上和原始數(shù)據(jù)方面的差異，會存在偶然的細小差別。9 質量控制方法9。 目的 質控的目的是監(jiān)測以下幾個方面：（1）藥敏試驗操作的精確度與準確度。（2）試驗中試劑的情況。（3）操作者的工作情況.使用遺傳上穩(wěn)定的參考菌株即可達到上述目的。9. 質控菌株 為了控制藥敏試驗的精確度和準確度，須從可靠來源獲得指控菌株。質控菌株如下:（1）大腸埃希氏菌 ACC 2922 ，（2）大腸埃希氏菌 ATCC 5，(）綠膿假單胞菌 ACC 275,（4)金黃色葡萄球菌 ATC 25923,(5)糞腸球

10、菌 ATC 222，（）流感嗜血桿菌C47（用于表3A的HM）,（）流感嗜血桿菌 ATCC 9766（用于表3A的HTM）,（8)淋病奈瑟氏菌ATC 4226(用于表B的瓊脂),（9）肺炎鏈球菌 CC 49(用于表C的羊血M瓊脂）。 大腸埃希氏菌AT 5218僅用于-內酰胺酶抑制劑合劑的質控.糞腸球菌AT 9212(或TC 3386)用于測試培養(yǎng)基中磺胺抑制劑的水平.糞腸球菌ATCC 29212還用于高濃度慶大霉素紙片的質控。 質控菌株測試和保存方法如下: （1）須用與臨床分離菌所用相同的抗生素測試質控菌株。 (2)日常用的質控菌株在大豆酪蛋白消化液瓊脂（MH瓊脂)上（普通菌株）或強化的巧克力

11、瓊脂上（嬌嫩細菌)4-8保存，每周傳代一次，如具備有長期保存的條件最好長期保存。用適當?shù)谋Ｗo劑，如5%小牛血清肉湯或脫纖維羊血,在-20以下保存.以上方法都不會改變細菌的抗菌藥物敏感性。 （3）日常使用的質控菌株應至少一個月更換一次，由凍干保存菌種移種或購買新菌種。 （)測定時，先將菌種接種肉湯,孵育48小時，然后劃種平板，得到單個菌落. （）按推薦的方法,挑取菌落，制備接種菌液。 (6）用這種質控菌株測出的抑菌環(huán)平均值如未出現(xiàn)明顯差異，該菌株就可以繼續(xù)用來監(jiān)測準確度和精確度。如平均直徑有明顯改變，且該差異不可能是由方法學造成的,表示質控菌株污染或敏感性發(fā)生變異，此時應更換新菌株。3抑菌環(huán)質量

12、控制界限 表3,3,3B和3C列出了一個質控結果允許出現(xiàn)的最大和最小抑菌環(huán)直徑。一般情況下，每20個測定結果只允許有一個失控(即,超出列表中所列的準確度控制范圍）。0個連續(xù)測定中任何多于一個以上的失控結果都必須對操作進行修正(如，一旦出現(xiàn)第二個失控結果,馬上修正）.另外,如果一個質控結果超過質量控制界限范圍中間值上下四個標準差范圍時也必須進行修正。修正后，繼續(xù)觀察連續(xù)20次測定的結果。 注意:本節(jié)指的是失控情況下如何處理，務必不要與在實驗條件穩(wěn)定時所進行的一周一次的質量控制項混淆(見9。3節(jié)）。9。4 質控測定的次數(shù) 每批新的H瓊脂或新的抗菌藥物紙片必須用質控菌株檢測。質控菌株每天與常規(guī)工作一

13、起測定，來檢測整個操作過程。只有在實驗結果合乎要求后，才能減少檢測次數(shù)。通過以下幾個方面可以判斷實驗是否符合要求。(1）同常規(guī)標本一起連續(xù)測定質控菌株0天。（）每種藥物對每種細菌，0個抑菌環(huán)中（如一個藥物對一種細菌的連續(xù)30天測定結果）,超出表3所給的范圍的應不多于3個。 注意:本過程是為了建立穩(wěn)定的制片擴散法藥敏試驗的質量控制方法,以達到最終可以進行每周監(jiān)測一次的目的，務必不要與93節(jié)中有關失控進行修正的措施相混淆. 達到以上要求,以后每周至少應測一次。如果試劑有變動，須連續(xù)監(jiān)測。每周監(jiān)測一次時，如發(fā)現(xiàn)有不符合要求的結果,應立即改為每日監(jiān)測,尋找原因以便解決。按下法查找原因：(）連續(xù)5天測定

14、質控菌株。(2)每種藥物對每種細菌，所測的這5個抑菌環(huán)不得超出表3的準確度范圍。每種藥物對每種細菌,連續(xù)測定的這5個抑菌環(huán)的范圍不應超出表3，A,B和3的精確度范圍。 如果達不到上述要求（只要有一個抑菌環(huán)直徑超出準確度范圍或抑菌環(huán)范圍大于精確度所允許的范圍），必須連續(xù)進行每日監(jiān)測。只有在以后連續(xù)測定了30次質控菌株且結果合格后才可以改為每周監(jiān)測.。 產生誤差常見的原因 只要有一次質控結果超出表3，3A，3B和C的允許范圍，應從以下諸方面查找原因。（1）記錄質控結果有無筆誤；(）測量抑菌環(huán)時是否讀錯；（3)質控菌株污染或有其他改變;(4)接種菌液過濃或過淡；(）比濁管沒有混勻；（6）孵育溫度或孵

15、育環(huán)境不對;(7）M-H瓊脂有批間差-每批培養(yǎng)基用前應鑒定；(8）藥敏紙片在保存和使用中是否失效. 一旦發(fā)現(xiàn)結果失控，先再仔細檢查一下平板,往往很容易解決。如果找不出明顯的操作失誤,就必須連續(xù)5天，每天測定質控菌株。當這連續(xù)5個結果均在允許的準確度范圍且所有值都不大于允許的精確度最大范圍，則可改行每周監(jiān)測。但只要有一個抑菌環(huán)超出準確度范圍或精密度允許范圍，就必須做每日監(jiān)測。直到當按。4節(jié)方法另做了0次質控并達到要求后，才可以恢復每周監(jiān)測.10 方法的局限性10。1 對各類細菌的適用性 本文介紹紙片方法是由快速生長的致病菌標定的，菌株包括腸桿菌科、葡萄球菌、腸球菌、綠膿假單胞菌、不動桿菌。經適當改動可用來測定嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈球菌.對那些未在表中列出的細菌，如使用的培養(yǎng)基不同、孵育環(huán)境不同或生長率不同等，尚沒有重復性好的標準方法。這類細菌的實驗結果不易解釋,不應用紙片法測定。0.2 易引起誤導的結果 當用某些抗生素測試某特定細菌時,可能出現(xiàn)嚴重的誤導，主要包括以下幾種情況(但不限于這幾種）：第一、第二代頭孢菌素和氨基糖苷類測沙門氏菌和志賀氏菌；所有內酰胺類抗生素（除了苯唑西林、甲氧西林和乙氧西林）測耐甲氧西林葡萄球菌；頭孢菌素、氨基糖苷類(除了高水平耐藥試驗)、林可霉素和甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異惡唑測腸球菌；頭孢菌素測李斯特菌。1.