蛋白質工程的崛起專題1基因工程

1、專題1 1 基因工程 一、蛋白質工程崛起的緣由 通過基因工程能夠大規(guī)模生產(chǎn)生物體內(nèi)微量存 在的活性物質，并借助轉基因而改變動植物性狀， 得以在人類醫(yī)療保健中進行基因診斷和基因治療。 然而在廣泛利用自然界各種蛋白質的過程中就發(fā)現(xiàn)， 這些蛋白質只是適應生物自身的需要，而對它們進 行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)往往不合意，需要加以改造。1983年 Ulmer首先提出蛋白質工程，它是指按照特定的需 要，對蛋白質進行分子設計和改造的工程。自此以 后，蛋白質工程迅速發(fā)展，已成為生物工程的重要 組成部分。 在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以 應用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應用于工業(yè) 生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，

2、但在工 業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生 產(chǎn)中每一步的反應體系中常常會有酸、堿或有機 溶劑存在，反應溫度較高，在這種條件下，大多 數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質的穩(wěn)定性是工 業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。 一般來說，提高蛋白質的穩(wěn)定性包括：延長 酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白 的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性 喪失等。 例如：干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。 將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進行表達，產(chǎn) 生的干擾素的抗病毒活性為106 U/mg，只相當于 天然產(chǎn)品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的 -干擾素量很多，但多數(shù)是以無活性的二聚體形 式存在。為什么會這

3、樣？如何改變這種狀況？研 究發(fā)現(xiàn)，-干擾素蛋白質中有3個半胱氨酸（第17 位、31位和141位），推測可能是有一個或幾個半 胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17 位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸， 結果使大腸桿菌中生產(chǎn)的-干擾素的抗病性活性 提高到108 U/mg，并且比天然-干擾素的貯存穩(wěn) 定性高很多。 改造 干擾素（半胱氨酸） 體外很難保存 干擾素（絲氨酸） 體外-70-70可以保存半年 玉米中賴氨酸含量比較低 天冬氨酸激酶 （352352位的蘇氨酸） 二氫吡啶二羧酸合成酶 （104104位的天冬酰胺） 天冬氨酸激酶 （異亮氨酸） 二氫吡啶二羧酸合成酶 （異亮氨酸） 玉米

4、中賴氨酸含量可提高數(shù)倍 改造 改造 5倍 2倍 1、基因工程的應用 （1）基因工程的實質：將一種生物的 轉移到另 一種生物體內(nèi)，使后者產(chǎn)生本不能產(chǎn)生的 ， 進而表現(xiàn)出新的 。 （2）基因工程的不足：在原則上只能生產(chǎn)自然界已存 在的 。 2、天然蛋白質的不足 天然蛋白質是生物在長期 過程中形成的， 它們的 符合特定物種 的需要，卻不 一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。 3、蛋白質工程的目的 生產(chǎn)符合人類生產(chǎn)和生活的需要的 。 基因 蛋白質 性狀 蛋白質 進化 結構和功能生存 蛋白質 “后基因組時代”將是“蛋白質組學時代”，即 從對基因信息的研究轉向對蛋白質信息的研究， 包括研究蛋白質結構、功能與

5、應用及蛋白質相 互關系和作用。 蛋白質工程就是在對蛋白質的化學、晶體學、 動力學等結構與功能認識的基礎上，對蛋白質 人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化的產(chǎn)品。 二、蛋白質工程的基本原理 基因 DNA mRNA 氨基酸序列 多肽鏈 蛋白質 三維結構 轉錄翻譯 生物功能 預期功能 折疊 分子設計 DNA合成 蛋白質工程 中心法則 流 程 圖 例1.科學家將干擾素基因進行定點突變導入大 腸桿菌表達，使干擾素第17位的半胱氨酸改變成 絲氨酸，結果大大提高了干擾素的抗病活性， 并且提高了儲存穩(wěn)定性。該生物技術為 A.基因工程 B.蛋白質工程 C.基因突變 D.細胞工程 B 蛋白質工程的概念 基礎: 實質：

6、途徑: 目標: 蛋白質的結構和功能 基因修飾或基因合成 改造或制造新的蛋白質，滿足 人類的生產(chǎn)或生活的需要 是對編碼蛋白質的基因進行改造 例2.以下關于蛋白質工程的說法正確的是（ ） A、蛋白質工程以基因工程為基礎 B、蛋白質工程就是酶工程的延伸 C、蛋白質工程就是用蛋白酶對蛋白質進行改造 D、蛋白質工程只能生產(chǎn)天然的蛋白質 A （1 1）從生物體中分離純化目的蛋白； （2 2）測定其氨基酸序列； （3 3）借助核磁共振和X X射線晶體衍射等手段，盡可能地了 解蛋白質的二維重組和三維晶體結構; ; （4 4）設計各種處理條件，了解蛋白質的結構變化，包 括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響； （

7、5 5）設計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變； （6 6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。 異亮氨酸半胱氨酸 基因定點誘變技術的示意圖 基因定點誘變技術的理解( (蘇教版) ) 項目內(nèi)容 條 件 原料 酶 引物 能量 操作方法 法 結果 適應范圍 后代中半數(shù)為誘變的分子 脫氧核苷酸 聚合酶和連接酶 含突變順序的分子片段 空間結構完全清楚的蛋白質 思考：基因定點誘變技術與基因突變的比較 比較基因定點誘變基因突變 相 同 點 發(fā)生的 過程 結果 不 同 點 場所 手段 方向 DNA復制過程中 產(chǎn)生新基因，從而產(chǎn)生新性狀 生物體外生物體內(nèi) 定向改造不定向性 PCR技術 物理化學方法 1、

8、目標：根據(jù)人們對 功能的特定需求， 對蛋白質的 進行分子設計。 2、原理：改造基因（基因 或基因 ） 。 3、途徑： 預期蛋白質功能設計 推測應 有的 序列找到對應的 序列。 蛋白質 結構 修飾合成 預期的蛋白質 氨基酸脫氧核苷酸 對天然蛋白質進行改造，你認為直接對蛋白質 分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？ （一）蛋白質的分子設計與改造 蛋白質工程首先是以蛋白質的結構為基礎， 通過蛋白質的一級結構、晶體結構和溶液構象的 研究，積累了成千上萬蛋白質一級結構和高級結 構的數(shù)據(jù)資料，并編制成系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫，得以從 中找出蛋白質分子間的進化關系、一級結構和高 級結構的關系、結構與功能的關系方面的

9、規(guī)律。 蛋白質作為生物大分子是生物化學和分子生 物學的研究重點，大量蛋白質被分離純化，測定 了它們的結構、性質和生物學作用。分子生物學 有關基因組的研究，也可以用以推測出一些未知 蛋白質的結構與功能。采用定位誘變的方法，可 以對編碼蛋白質的基因進行核苷酸密碼子的插入、 刪除、置換和改組，其結果為分子改造提供新的 設計方案?，F(xiàn)有的蛋白質是生物長期進化的結果， 蛋白質工程則是對生物進化的模擬，按照蛋白質 形成的規(guī)律，改造蛋白質或構建新的蛋白質。 蛋白質的改造通常需要先經(jīng)周密的分子設 計，然后依賴基因工程獲得突變型蛋白質，以 檢驗其是否達到了預期的效果。如果改造的結 果不理想，還需要重新設計再進行改

10、造，往往 經(jīng)歷多次實踐摸索才能達到改進蛋白質性能的 預定目標。 （二）蛋白質改造工程舉例 1水蛭素改造 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑， 它有多種變異體，由65或66個氨基酸殘基組成。水 蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病。 為提高水蛭素活性，在綜合各變異體結構特點的基 礎上提出改造水蛭素主要變異體HV2的設計方案， 將47位的Asn（天冬酰胺）變成Lys（賴氨酸），使 其與分子內(nèi)第4或第5位Thr（蘇氨酸）間形成氫鍵 來幫助水蛭素N端肽段的正確取向，從而提高凝血 效率，試管試驗活性提高4倍，在動物模型上檢驗 抗血栓形成的效果，提高20倍。 2生長激素改造 生長激素通過對它特

11、異受體的作用促進細胞和 機體的生長發(fā)育，然而它不僅可以結合生長激素受體， 還可以結合許多種不同類型細胞的催乳激素受體，引 發(fā)其他生理過程。在治療過程中為減少副作用，需使 人的重組生長激素只與生長激素受體結合，盡可能減 少與其他激素受體的結合。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者受體結 合區(qū)有一部分重疊，但并不完全相同，有可能通過改 造加以區(qū)別。由于人的生長激素和催乳激素受體結合 需要鋅離子參與作用，而它與生長激素受體結合則無 需鋅離子參與，于是考慮取代充當鋅離子配基的氨基 酸側鏈，如第18和第21位His（組氨酸）和第17位Glu （谷氨酸）。實驗結果與預先設想一致，但要開發(fā)作 為臨床用藥還有大量的工作要做。 3

12、胰島素改造 天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和 六聚體，延緩胰島素從注射部位進入血液，從 而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這 是胰島素23-28氨基酸殘基結構所致。利用 蛋白質工程技術改變這些殘基，如28位改為 賴氨酸、 29位改為脯氨酸，則可降低其聚合 作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已 通過臨床實驗。 4治癌酶的改造 癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細 胞，特異性地抑制或殺死癌細胞；藥物保護正常細 胞免受化學藥物的侵害，可以提高化學治療的劑量。 皰疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸 腺嘧啶和其它結構類似物磷酸化而使這些堿基3- OH缺乏,從而阻斷DNA的合成

13、，殺死癌細胞。HSV TK催化能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨 機突變中進行篩選出一種酶,在酶活性部位附近有6 個氨基酸被替換，催化能力20倍以上。 蛋白質工程的發(fā)展很快，研究工作很多，以 上僅介紹了幾個例子。蛋白質工程除了用于改造 天然蛋白質或設計制造新的蛋白質外，其本身還 是研究蛋白質結構功能的一種強有力的工具，它 在解決生物理論方面所起的作用，可以和任何重 大的生物研究方法相提并論。 例3.干擾素是動物體內(nèi)的一種蛋白質，可以用來 治療病毒的感染和癌癥，但在體外保存相當困難， 如何長期保存，科學家發(fā)現(xiàn)干擾素中的一個半胱 氨酸變成絲氨酸，可以保存半年。你來設想一下， 能不能讓動物生產(chǎn)能

14、夠長期儲存的干擾素？采用 什么方法？ 能生產(chǎn)長期儲存的干擾素。用氨基酸序列 反推信使RNA序列，再反推DNA序列，然后進 行基因改造。 何謂蛋白質工程？ 在現(xiàn)代生物技術中，蛋白質工程出現(xiàn)得最晚，是 在20世紀80年代初期出現(xiàn)的。1983年 “蛋白質 工程”這個名詞出現(xiàn)后，隨即被廣泛接受和采用。 是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其與 生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因 合成，對現(xiàn)有蛋白質進行改造，或制造一種新的 蛋白質，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。 對照密碼表，至少寫出三種決定“丙氨 酸色氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸” 的脫氧核苷酸序列。 （1 1）mRNAmRNA序列為： GCUGCU（或

15、C C或A A或G G）UGGAAAUGGAAA（或G G）AUGUUUAUGUUU（或C C） 脫氧核苷酸序列： CGACGA（或G G或T T或C C）ACCTTTACCTTT（或C C）TACAAATACAAA（或G G） （2 2）確定目的基因的堿基序列后，就可以根據(jù)人類的 需要改造它，通過人工合成的方法或從基因庫中獲取。 起始密碼 比較項目基因工程蛋白質工程 程序上 合成的是否是 自然蛋白質 順著中心法則逆著中心法則 是不是 蛋白質工程和基因工程的區(qū)別 項目蛋白質工程基因工程 區(qū) 別 原理中心法則的逆推基因重組 過程 預期蛋白質功能設計蛋白質 結構推測氨基酸序列推測 脫氧核苷酸序列合

16、成DNA 表達出蛋白質 獲取目的基因構建表達載體 導入受體細胞目的基因的檢測 與鑒定 實質 定向改造或生產(chǎn)人類所需蛋白 質 定向改造生物的遺傳特性，以獲 得人類所需的生物類型或生物產(chǎn) 品(基因的異體表達) 結果生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質生產(chǎn)自然界中已有的蛋白質 聯(lián)系 蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，因 為對現(xiàn)有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基 因合成實現(xiàn) 重組創(chuàng)新 1.1.進展胰島素速效型藥品 2.2.前景 制作電子元件 3.3.現(xiàn)狀 蛋白質工程目前成功的例子不多, ,原因是對蛋白質的高 級結構了解不夠。要設計出更加符合人類需求的蛋白質 還需經(jīng)過艱辛的探索

17、。 應用于微電子方面 具耗電少和 的特點 體積小 效率高 三、蛋白質工程的進展和前景 如28位改為賴 氨酸、29位改 為脯氨酸，則可 降低其聚合作用， 使胰島素快速起 作用。 例4.某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋 白酶的結構和功能很相似，只有對熱穩(wěn)定性較差， 進入人體后容易失效。現(xiàn)要將此酶開發(fā)成一種片劑， 臨床治療食物的消化不良，最佳方案是 A.對此酶中的少數(shù)氨基酸替換，以改善其功能 B.將此酶與人蛋白酶進行拼接，形成新的蛋白酶 C.重新設計與創(chuàng)造一種全新的蛋白酶 D.減少此酶在片劑中的含量 A 1、下列關于蛋白質工程的說法錯誤的是 A蛋白質工程能定向改造蛋白質分子的結構，使 之更加

18、符合人類的需要 B蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接 進行操作，定向改變分子的結構 C蛋白質工程能產(chǎn)生出自然界中不曾存在過的新 型蛋白質分子 D蛋白質工程與基因工程密不可分，又被稱為第 二代基因工程 B 練習 3、下列各項中不屬于蛋白質工程在醫(yī)學上應用的 是（ ） A.基因芯片用于HIV診斷 B. t-PA用于醫(yī)治心肌梗死 C.速效胰島素用于治療糖尿病 D. 人鼠嵌合抗體用于識別、殺傷腫瘤細胞 2、蛋白質工程中直接需要進行操作的對象是 A氨基酸結構 B蛋白質空間結構 C肽鏈結構 D基因結構 D A 4、蛋白質工程的基本流程正確的是 蛋白質分子結構設計 DNA合成 預期蛋白質功能 根據(jù)氨基

19、酸序列推出脫氧核苷酸序列 A B C D C 5、蛋白質工程是在基因工程基礎上，延伸出來 的第二代基因工程，其結果產(chǎn)生的蛋白質是 A氨基酸種類增多 B氨基酸種類減少 C仍為天然存在蛋白質 D可合成天然不存在蛋白質 D 6、枯草桿菌產(chǎn)生的蛋白酶具有催化分解蛋白質的 特性，但極易被氧化而失效。1985年，美國的埃 斯特爾將枯草桿菌蛋白酶分子中的第222位氨基酸 替換后，雖然其水解活性有所下降，但抗氧化能 力大大提高。用這種水解酶作為洗滌劑的添加劑， 可以有效地除去血漬、奶漬等蛋白質污漬。 （1）改造枯草桿菌蛋白酶的生物技術 是 。 （2）改造后的枯草桿菌中的控制合成蛋白酶的基 因與原來相比，至少有 個堿基對發(fā)生變化。 （3）利用生物技術改造蛋白質，是提高了蛋白質 的 性，埃斯特爾所作的工作是對已知蛋白質 進行 。 蛋白質工程 1 穩(wěn)定 少數(shù)氨基酸的替換 （P28） 1.解析：蛋白質工程的崛起主要是工業(yè)生產(chǎn)和基礎理 論研究的需要。而結構生物學對大量蛋白質分子的精 確立體結構及其復雜的生物功能的分析結果，為設計 改造天然蛋白質提供了藍圖。分子遺傳學的以定點突 變?yōu)橹行牡幕虿僮骷夹g為蛋白質工程提供了手段。 在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應用于工 業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶 雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性 或活