MAF1基因的時空差異表達研究畢業(yè)論文

1、 2006屆基礎醫(yī)學（生物技術方向）專業(yè)本科學位論文 論文題目：maf-1基因的時空差異表達研究學 生： 年 級：2006級 專 業(yè)：醫(yī)學生物技術 指導教師： 實習單位：生物技術實訓中心 2011年 3 月 3 日目 錄 摘 要 第3頁1. 前 言 第4頁2. 材料與方法 第6頁3. 結(jié) 果 第11頁4. 討 論 第15頁參考文獻 第17頁致 謝 第19頁maf-1基因的時空差異表達研究 【摘要】 家蠅體內(nèi)豐富的抗細菌肽、抗真菌肽等是其免疫防御機制中不可或缺的部分。家蠅抗真菌肽-1（musca domestica antifungal peptide-1,maf-1）是從家蠅幼蟲血淋巴中所提取

2、的，并采用固相萃取結(jié)合反相高效液相色譜(rp-hplc)的方法分離到的一種新發(fā)現(xiàn)的抗真菌肽。為了進一步研究該基因在家蠅幼蟲各個部位以及各個齡期的表達是否存在著差異，我們采用了real time-pcr技術研究了該基因在不同的發(fā)育時期(卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、成蟲以及雌雄)和幼蟲不同的部位(脂肪體、腸道、體壁、唾液腺)的表達量，結(jié)果顯示maf-1基因在所選的不同時期個部位都有所表達。其中幼蟲期間的表達量比較高，而不同部位中，唾液腺、脂肪體表達量較高。而且，在整個家蠅的生長發(fā)育階段，maf-1基因的表達量是呈現(xiàn)下降趨勢的。進一步肯定了抗菌肽在家蠅的免疫防御體系和生長發(fā)育期間，尤其是幼

3、蟲期間發(fā)揮著重要作用。為其下一步更深入探索其免疫機制的研究，豐富對昆蟲天然免疫的認識及新一代抗真菌生物制劑的研制奠定了理論基礎?！娟P鍵詞】家蠅 抗菌肽maf-1 real time-pcr 時空表達abstract inside the house antimycobacterial peptides, rich of antifungal peptide immune defenses such is the indispensable part. domestica antifungal musca domestica peptide - 1 (musca domestica antifu

4、ngal peptide-1, maf - 1) domestica larva in from blood lymph extracting, and by solid-phase extraction combined with reversed phase high performance liquid chromatography (hplc) method of rp - a new separation to discovery of antifungal peptides. in order to further study the gene domestica larva ea

5、ch place and all periods of expression whether there is any difference between, we use the real time-pcr technology research the genes in the different developmental stages (eggs, larvae, 2 age 1 year, 3rd instar larvae grubs and pupa, adult and male and female) and different parts (fat body, the in

6、testinal tract, the body wall, salivary gland) expression and results showed that in re-ligion maf - 1 genes in different periods of a site have expressed. the expression of larvae quantity taller during, and different parts of salivary glands, fat body, express high. and, in the whole growth stage,

7、 the domestica maf - 1 gene expression of the quantity is the downward trend. further affirmed domestica antibacterial peptides in the immune defense system and growth plays an important role. for its next more in-depth study of exploring the immune mechanism of insects, rich natural immune awarenes

8、s and a new generation of antifungal biological preparation research laid a theoretical foundation. keywards：musca domestica antifungal peptide af-1 rt-pcr temporal and spatial expression 前言 昆蟲是世界上最大的生物種群。為適應各種不同的生態(tài)環(huán)境，它們形成了獨特的免疫系統(tǒng)，即缺乏b、t淋巴系統(tǒng)，不能產(chǎn)生免疫球蛋白和補體。昆蟲特別是蠅類能夠有效的抵御病原微生物的入侵, 而本身不受感染. 天然免疫是它們對抗各種微

9、生物入侵的一線防御系統(tǒng), 這和哺乳動物有一定的相似性, 這說明了它們之間有一定的進化關系1,2.近年來研究發(fā)現(xiàn)昆蟲體內(nèi)許多活性物質(zhì)，具有高等動物免疫分子類似的功能，如抗菌肽便是典型的代表。白1974年boman等首次從惜古比天蠶蛹誘導分離純化出第一種天然抗菌肽天蠶素(cecropin)以來，昆蟲抗菌肽逐漸成為生命科學領域研究的熱點。目前研究表明, 以cecropins, attacins, drosomicins 等抗菌肽產(chǎn)物為基礎的天然免疫是昆蟲抵御病原體和寄生蟲的重要防線.近年來, 人們也開始在蠅類中探索免疫系統(tǒng)的起源和進化, 為研究昆蟲天然免疫和人類的天然免疫的相關性提供證據(jù).。家蠅(m

10、usca domestica)屬昆蟲綱、雙翅目、環(huán)裂亞目、家蠅科，是我國大部分地區(qū)最常見、數(shù)量最多的一種媒介昆蟲。在自然界中，家蠅是傳播疾病的重要媒介害蟲，它能給人、畜傳染多種疾病，但自身并不染病，即使在高密度人工飼養(yǎng)的條件下也不會發(fā)生大規(guī)模傳染病而死亡。家蠅對惡劣環(huán)境具有極強的適應能力和獨特的免疫防御機制(王繼恒等，2000)，預示家蠅體內(nèi)含有豐富的抗菌物質(zhì)。目前，家蠅的高效抗病能力的研究受到了廣泛的關注(崔曉江，劉枝俏，1995；okada，natori，1984；孫剛等，1995；賴凡等，1999)。家蠅體內(nèi)外具有多種抗菌物質(zhì)是其在雜菌橫生的環(huán)境中得以生存的重要物質(zhì)基礎，對家蠅抗菌活性物

11、質(zhì)的進一步研究具有十分重要的理論意義和應用價值。有關學者已在地中海實蠅ceratitiscapitata、4果蠅drosophilam elanogaster5和廄赦蠅stonxoxyspo regrinn6中分離到具有不同生物活性的抗菌膚。在棕尾別麻蠅sarcophagaperegrina和伏蠅phormia terranova。體內(nèi)分離到了sarcotoxini 7.8.9和diptericin等 具有抗菌活性的蛋白。而在家蠅血淋巴中既分離到了分子量較小的生物活性膚/蛋白，又分離到分子量較大的凝集素溶菌酶等多種抗菌膚。這些抗菌膚抗細菌、真菌、寄生蟲，更引人注目的是它們還能殺傷多種腫瘤癌細胞

12、和病毒，而對正常的體細胞無毒副作用。抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，如金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、綠膿假單胞菌、大腸桿菌等。還抗植物細菌性病害如水稻白葉枯病菌，大白菜軟腐病菌和引起人類疾病的痢疾桿菌、肺炎桿菌。對一些真菌如白念珠菌和白僵菌也有很好的生物活性，也對令人畏懼的腫瘤癌細胞有活性。邱曉燕等分離到分子量為4 kda和9.6 kda的抗菌膚，較低濃度下能有效抑制人胃癌細胞mgc80-3和bgc-823、人乳腺癌細胞mcf-7以及人肺癌細胞spc-a-1的體外增殖。11還抑制病毒侵染和繁殖，陳艷等用蠅蛆組織勻漿液處理流感病毒表現(xiàn)出非常好的防效。12這些抗菌膚活性濃度在ug/ml級，其抑菌效果與

13、傳統(tǒng)抗生素相當甚至超過之。有報道表明蒼蠅抗菌膚的抗菌活性超過了青霉素13，與目前廣泛使用的抗生素及農(nóng)用殺菌劑不產(chǎn)生交互抗性，不誘導病原菌產(chǎn)生抗性突變，因此有望開發(fā)成為新一代優(yōu)秀抗癌、抗病毒或抗病菌藥物。m 家蠅抗真菌肽-1（musca domestica antifungal peptide-1,maf-1）是從家蠅幼蟲血淋巴中所提取的，并采用固相萃取結(jié)合反相高效液相色譜(rp-hplc)的方法分離到的一種新發(fā)現(xiàn)的酸性抗真菌肽。在家蠅防御體系中發(fā)揮著重要作用。那么，究竟此抗真菌肽是如何發(fā)揮免疫作用，乃至此抗真菌肽在整個免疫系統(tǒng)中是如何表達。換言之，是否此抗真菌肽在家蠅從卵到成蟲的各個齡期都有所

14、表達。是否存在雌雄的表達差異。是否于幼蟲的各個部位都有所表達，即是否存在著組織分布的特異性。這一系列的問題，都有待著我們進行深入的研究。于是，本文采用了real time-pcr技術對該基因在不同的發(fā)育時期(卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、成蟲以及雌雄)和幼蟲不同的部位(脂肪體、腸道、體壁、唾液腺)的表達情況進行研究分析。材料與方法1.材料1.1 實驗蠅株來源 實驗室蟲室常規(guī)養(yǎng)殖。溫度（25）相對濕度（80%）光照（12h/d）1.2 maf-1序列來源 前期從家蠅幼蟲分離到的maf-1蛋白的n端序列，通過race技術獲得了maf-1的部分cdna序列，已登錄到genbank，獲得登錄號

15、，登錄號hm178948。1.3 主要生物信息學分析網(wǎng)站，軟件和引物設計軟件 家生物技術信息中心網(wǎng)站（national center for biotechnology information,ncbi）；瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)網(wǎng)站（expert protein analysis system,expasy）； dnaman軟件；primer premier 5.0; oligo 6.01.4 主要試劑、試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（abi公司）；primescript rt reagent kit with gdna eraser；sybr premix ex taqtm ；限制性內(nèi)切

16、酶（以上均為大連寶生物公司）；trizol試劑；質(zhì)粒提取試劑盒；無rnasc的dnase ；taq dna聚合酶；pcr引物；dna marker；1.5 主要溶液01depc水：lmldepc加入1l三蒸水中，振蕩過夜后15psi高壓滅菌。hepes saline 0.15mol/l nacl,10mmol/l hepes,調(diào)節(jié)ph=7.0 。20umol/l腺苷hs液 1.336mg 腺苷溶于250ul hs5xtbe電泳緩沖液 tiis堿54g、硼酸27.5g、0.5mol/l edta(ph8.0)加三蒸水至900ml,充分溶解，定容1000ml.使用時，稀釋10倍至0.5 x tbe

17、1.6 主要實驗儀器 abi 7300 real-timepcr system pcr擴增儀（德國 eppengorf公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；顯微解剖鏡（尼康）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國ge公司）；紫外分光光度計（美國ge公司）；5415型冷凍離心機（德國eppengorf公司）；pb203-e型電子精密天平（上海梅特勒托利多儀器公司）；微量加量器（10ul 20ul 100ul 1000ul德國 eppengorf公司） 2. 方法2.1 總rna的提取 1）于顯微鏡下，解剖家蠅三齡幼蟲，提取其體壁、腸道、脂肪體、唾液腺，另取家蠅不同的發(fā)育時期(卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼

18、蟲、蛹、成蟲以及雌雄)組織約30ug，分裝于ep管中。采用trizol試劑提取總rna。 2)提取物浸于1000ul trizol 中；震蕩混勻，避光，反復凍融3次；3)加400ul trizol,室溫放置5分鐘，加入100ul氯仿，漩渦震搖15s，靜置5min，4，12000rpm離心15min。4)仔細吸取上層水相，移至另一新的離心管仲，加等體積異丙醇，上下顛倒混勻。5)室溫放置10min，然后于4，12000rpm離心20min沉淀rna，棄去上清。6)加入lml 75乙醇，輕輕震搖，充分洗滌rna沉淀，4，12000rpm離心7500g，5分鐘，棄上清，除去乙醇。7)室溫干燥rna，重

19、溶rna于100ul rnase-free水中，65水浴10min以助溶。2.2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定總rna的完整性 對消化后的rna樣品用瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測rna分子的完整性。 l)用0.5 x tbe 100ml溶解1g瓊脂糖。配置1%瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至完全融化后，室溫冷卻至60度左右，加入 5ul eb，混勻，倒入插好梳齒的制膠槽中冷卻制膠。2)將制好的膠塊浸沒于裝有0.5 x tbe 電泳緩沖液的電泳槽中。3)取1ul rna樣品，加入1ul 10 x loading buffer 混勻后上樣。4)100v電壓下電泳。5)電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察，鑒定rna分子的完整性。

20、2.3 總rna定量 用98ul milli-q水將 2ul rna 原液稀釋50倍后，利用紫外分光光度計分別測定其在 260nm 和 280nm 波長處的吸光度（od260 和 od 280）通過下述公式計算rna的濃度。同時，計算od260 和od280 的比值（od260/od280），當兩者的比值在1.82.2時，說明提取的rna純度高，無蛋白質(zhì)和dna的殘余。 2.4 總rna去除dna基因組 1)在微量離心管中分別加入下列成分試劑使用量5 x gdna raser buffer2ulgdna eraser1ultotal rna1ugrnase free dh2oup to 10u

21、l 2)42反應2分鐘2.5 逆轉(zhuǎn)錄合成cdna1) 向pcr小管中分別加入下列成分試劑使用量5 x primescript buffer 2(for real time)4ul primescript rt enzyme mix 11ulrt primer mix 1ul2.4的反應液10ulrnase free dh20up to 20ul2) 37 15 min3) 85 5 sec4) -20 保存。2.6 設計引物利用primer premier 5.0 和 oligo 6.0 軟件設計引物。引物由takara公司合成。maf-1 forward: 5-tgctgtcttcagtgc

22、catcc-3 reverse: 5-ccctcaatccagaccttcat-3 gapdh forward: 5-catcatctccgctccatc-3 reverse: 5-aagccataccagtgagtttacc-32.7 實時熒光定量rt-pcr分析maf-1基因的時空表達差異樣品為家蠅卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、成蟲（雌、雄)和家蠅幼蟲脂肪體、腸道、體壁、唾液腺所提取的總rna所反轉(zhuǎn)錄的模板cdna。熒光定量pcr反應體系如下試劑使用量終濃度sybr premix ex taptm(2x)25ul1xpcr forward primer (10um)2ul0.4um

23、pcr reverse primer (10um)2ul0.4umrox reference dye(50x)01ul1x模板（cdna）溶液10uldh2o10ultotal50ul使用abi 7300熒光定量pcr儀：95 30秒。95 5 秒、60 34秒：40 cycles.每個模板設立3個復孔，進行數(shù)據(jù)分析，獨立重復3次。 3.0 結(jié)果 3.1 maf-1 總rna的提取分別對家蠅的卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、成蟲（雌、雄)和脂肪體、腸道、體壁、唾液腺的總rna進行提取的11個樣品的rna瓊脂糖凝膠電泳圖（圖3.1）結(jié)果顯示可見清晰的28s和18s兩條帶，表明rna完整性較

24、好，無降解。經(jīng)分光光度計檢測，其od260 od280比值均在2.0左右，介于1.82.2之間，說明rna的純度較高。3.2 熔解曲線分析在pcr擴增后進行熔解曲線分析，結(jié)果見下圖。從熔解曲線看出， 目標基因和參照基因的pcr擴增產(chǎn)物分別在84和88達到峰值， 無非特異產(chǎn)物和引物二聚體， 整個實驗過程沒有污染，目標基因和參照基因表達穩(wěn)定。maf-1基因熔解曲線圖：gapdh基因熔解曲線圖：3.3 maf-1基因在各個時期和不同部位的表達差異3.2.1 maf-1基因在家蠅不同時期的表達差異，以卵為參照組，結(jié)果如下表。 樣品 gapdh基因ct值均數(shù)標準差 樣品基因ct值均數(shù)標準差 ct ct

25、2-ct 卵17.1290.49424.4750.190 7.346 0 11齡幼蟲 18.0060.57918.0491.9290.043-7.303157.915 2齡幼蟲18.2570.907 19.0070.831 0.750 -6.596 96.737 3齡幼蟲18.7420.76124.2750.7655.533-1.813待添加的隱藏文字內(nèi)容13.514蛹18.6590.65727.4370.2858.7781.4320.371雄蠅17.4830.72325.8510.7428.3681.0220.492雌蠅 18.3750.94128.3101.8569.9352.5890.1

26、66將相對表達值轉(zhuǎn)化為以lo為底的對數(shù)，在excel中作圖，得到maf-1基因在家蠅從卵到成蟲的各個生長發(fā)育階段中的表達對比。如下圖3.2.2 maf-1基因在家蠅幼蟲各個部位的表達差異，以體壁為參照組，結(jié)果如下表。 樣品 gapdh基因ct值均數(shù)標準差 樣品基因ct值均數(shù)標準差 ct ct 2-ct 體壁19.3580.465 24.2140.877 4.896 0 1 唾液腺19.6220.473 20.9330.991 1.311 -3.585 12.001 脂肪體19.6900.30121.1980.2011.508 -3.388 10.469 腸道 21.1330.562 25.87

27、31.5214.740-0.1561.114將相對表達值轉(zhuǎn)化為以lo為底的對數(shù)，在excel中作圖，得到maf-1基因在家蠅幼蟲各個部位的表達對比。如下圖4.0結(jié)論與討論基因表達是調(diào)控生命活動的重要機制, 不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下基因的表達決定了整個生命過程, 包括發(fā)育和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、對逆環(huán)境的反應等, 因此比較不同發(fā)育階段的基因表達可為分析生命活動過程提供重要信息。實時熒光定量rt-pcr技術常常用于對基因mrna的表達水平進行分析，結(jié)果非常可靠，具有可比性和重復性。本文通過半定量rt-pcr技術，研究了家蠅抗真菌肽-1（musca domestica antifungal pept

28、ide-1,maf-1）在家蠅不同生長發(fā)育階段（卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、成蟲以及雌雄)和幼蟲不同的部位(脂肪體、腸道、體壁、唾液腺)的表達情況，結(jié)果顯示maf-1基因在所選的不同時期各部位都有所表達。其中幼蟲期間的表達量比較高，而不同部位中，唾液腺、脂肪體表達量較高。而且，在整個家蠅的生長發(fā)育階段，maf-1基因的表達量是呈現(xiàn)下降的趨勢的。這一系列結(jié)果其原因可能是：抗菌肽基因在家蠅卵期缺乏轉(zhuǎn)錄活性其表達的可能為母源性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所檢測到的可能是母體的遺留，故呈低水平表達整個家蠅幼蟲期抗菌肽基因表達呈下降趨勢，在1齡幼蟲期達到最大轉(zhuǎn)錄活性可能是隨著幼蟲的不斷發(fā)育其免疫防御機制逐漸完善

29、同時也表明抗菌肽在家蠅幼蟲發(fā)育中具有重要的作用；完全變態(tài)的昆蟲在蛹期對外界具有較強抵抗力。而家蠅蛹期抗菌肽基因表達呈低水平。蛹期的發(fā)育前期齡幼蟲期與蛹期的發(fā)育后期成蟲期表達均明顯趨高，說明家蠅蛹期抗菌肽轉(zhuǎn)錄途徑較復雜同時也說明在家蠅免疫體系中抗菌肽可能不是惟一的防御免疫分子，同時也表明抗菌肽在家蠅幼蟲發(fā)育中具有重要的作用;家蠅成蟲期抗菌肽表達量降低。大概因為此期家蠅免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟所致，另一方面也是家蠅成蟲期活動范圍增大，受外界刺激的幾率大大增加機體自身免疫系統(tǒng)適應進化的結(jié)果。這也是昆蟲適應防御微生物入侵的主要方式。唾液腺、脂肪體的高表達量可能與抗菌肽合成分泌有關。本文采用實時定量pcr 的方

30、法, 研究抗菌肽maf-1為基因在家蠅不同發(fā)育期及家蠅幼蟲不同部位的表達情況。所呈現(xiàn)的研究數(shù)據(jù)進一步肯定了抗菌肽在家蠅的免疫防御體系和尤其是幼蟲期間的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。參考文獻1. graczykt .k .，knightr .，gilmanr .h .，granfieldm .r .mic ro bes i nfec.,2001,3:231一235.2. sukontason k.，bunchoom .，khantawab .，sukantason k ，pia ng jai s .，choochotew .j .v ectore col.，2000,25:114-11 7 .3.

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