AD轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

1、轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定、 剪鼠尾1. 剪鼠尾的時(shí)間 當(dāng)新生的小鼠年齡達(dá)到兩到三周（耳朵已經(jīng)長(zhǎng)開(kāi)）時(shí)剪鼠 尾較好，此時(shí)鼠尾剪起來(lái)比較容易且小鼠的生命力比較強(qiáng)。2. 分辨小鼠的年齡a當(dāng)小鼠整個(gè)身體較紅且腹部無(wú)奶時(shí)，此小鼠當(dāng)天出生或前一晚出生; b當(dāng)小鼠腹部有奶（腹部有一小團(tuán)白色物質(zhì)），此小鼠出生23 天; c當(dāng)小鼠背部長(zhǎng)出皮毛時(shí)，此小鼠出生 34天；d當(dāng)小鼠毛長(zhǎng)全，但眼未開(kāi)時(shí)，此小鼠出生 10天左右；e當(dāng)小鼠眼剛開(kāi)，耳未開(kāi)時(shí)，此小鼠出生 12天左右；f當(dāng)小鼠耳剛開(kāi)時(shí)，此小鼠出生14天左右。3. 剪鼠尾后對(duì)小鼠的標(biāo)記 ：打耳孔法二、從鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)：CW2094）

2、提取DNA，操作如 下：1. 剪取小鼠長(zhǎng)度為的尾巴，放入滅菌后的離心管中，加入180卩L Buffer GTT震蕩混勻。2. 加入20卩L proteinase ,渦旋震蕩，徹底混勻。3. 置于56C水浴，直到組織溶液完全清澈，一般需消化6-8h,賦予過(guò)程中渦旋 震蕩，使樣品均勻分離。1） 如果賦予和渦旋震蕩后仍然有膠狀物質(zhì)，必要時(shí)過(guò)夜消化再加入20 d protei nase K消化，不會(huì)影響后續(xù)操作。2）如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入 4濃度為100mg/d的 RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置 5-10min。4.14000rpm離心1min，以消除未消化的類似于鼠毛等組織

3、，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的滅過(guò)菌的離心管中。5. 加入200 ilBuffer GL ,渦旋震蕩，充分混勻，加入 200 d無(wú)水乙醇，渦旋振蕩，充分混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。1）加入 Buffer GL 和無(wú)水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。2）如果多個(gè)樣品一起操作， Buffer GL 和無(wú)水乙醇可以等比例混勻后一起 加入樣品。3）加入 Buffer GL 和無(wú)水乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀， 不會(huì)影響后續(xù)操作。6. 將步驟 5 中所得到的溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中， 若以此不能 加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。lOOOOrpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將 吸附柱重新放回收集管中

4、。7. 向吸附柱中加入500 pl Buffer GW1 （使用前檢查是否已加無(wú)水乙醇）,10000 rpm離心1mi n,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。8. 向吸附柱中加入 500 pl Buffer GW2 （使用前檢查是否已加無(wú)水乙醇），10000 rpm離心1mi n，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。如需 進(jìn)一步提高 DNA 純度，可重復(fù)步驟 8。9.12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以 徹底晾干。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù) 的酶促反應(yīng)（酶切，PCR等）。10.將吸附柱置于一個(gè)

5、新的滅過(guò)菌的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200 p Buffer GE 或滅菌水，室溫放置 2-5min，10000rpm 離心 1min,收 集DNA溶液，-20 C保存DNA。1） 如果下游實(shí)驗(yàn)對(duì)PH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫，洗脫液的PH 值對(duì)洗脫效率有很大影響，若用水作洗脫液應(yīng)保證其 PH 值在直接， PH 值 低于時(shí)洗脫效率不高。2）離心前室溫孵育 5min 可增加產(chǎn)量。3）用另外的50-200 p L Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產(chǎn)量。4）如果需要提高 DNA 的終濃度，可以將步驟 10所得的 DNA 洗脫液重新 加至吸附膜上，重復(fù)步驟10;若洗

6、脫體積小于200pL，可以增加DNA的 終濃度，但可能會(huì)減少總產(chǎn)量。三、PCRPCR程序設(shè)定：1=94.0Tfor 5:002=94.0Tfor 1:003=59.0Tfor 0:504=72.0Tfor 1:005=Goto 22times6=94Tfor0:507=58Tfor 0:508= 72T for 1:009= Goto 62times10=94.0Tfor 0:5011=56.0Tfor 0:5012=72.0Tfor 1:0013= GotolO 32times14= 72OC for 10:0015= 4.0C for 5:0016= END 目前實(shí)驗(yàn)室的雙轉(zhuǎn)基因小鼠 AD

7、 體系采用：PCR反應(yīng)的體系（12 pl）: APPPrimer APP-1pPrimer APP-2plddH2O2plmix（ CW0682）6plDNA1 plPCR反應(yīng)的體系（12 p）: PS1Primer PS1-1plPrimer PS1-2pl內(nèi)參 -11 pl內(nèi)參-21plmix（ CW0682） 6plDNA1 pl先在的EP管中加入總的體系再平均分裝入各個(gè) PCR管中（一般多加兩小管 的量），將移液器調(diào)到總量的1/3到1/2體積在EP管中緩慢抽吸若干次（盡量避 免產(chǎn)生氣泡）以便Taq酶混合均勻，最后再在各 PCR管中依次加入DNA樣品。引物處理方法： 引物在安基生物有限公司合成后， EP 管上會(huì)有標(biāo)記，一般為 x nmol,使用前先用12000rpm離心1min,加入10x pddH2O，渦旋振動(dòng)混勻， 微型離心機(jī)離心，即可得到100 的母液，取10 p的母液，用ddH2O稀釋10 倍，即加入90 p，混勻后即可得到10側(cè) 的引物工作液。四、 電泳1配膠：鑒定用的膠板有大、 中、小3種，分別用的梳子為 50、25、11齒。 分別用的*TBE的量為90ml、45ml、25ml。用的瓊脂糖凝膠。2. 點(diǎn)樣：12 p的DNA，Marker加5P。點(diǎn)樣時(shí)注意逐個(gè)點(diǎn)樣，不要點(diǎn)錯(cuò)， 最好把