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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)組分析蛋白質(zhì)組(proteome)源于蛋白質(zhì)(protein )與基因組(genome)兩個(gè)詞的雜合,其定義 為proteins expressed by a genome,即一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。目前認(rèn)為蛋白質(zhì)組的內(nèi) 涵是一個(gè)細(xì)胞、一類組織或一種生物的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究蛋白質(zhì)組的一門新興學(xué)科,旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì) 的表達(dá)模式及功能模式。蛋白質(zhì)化學(xué)著重于單一蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的研究,例如某一種蛋白 質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的全序列分析,三維立體結(jié)構(gòu)的確定,這樣的結(jié)構(gòu)如何執(zhí)行功能、在生理上 所扮演的角色,以及代謝的生化機(jī)制等。蛋白質(zhì)組學(xué)則是研究
2、多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜系統(tǒng)。 Proteomics的字尾-omics”的意思是組學(xué)”,代表對生物、生命體系研究工作方式的重新 定義,也就是說,蛋白質(zhì)組學(xué)是對基因組所表達(dá)的整套蛋白質(zhì)的分析,其研究對象是多蛋白 質(zhì)混合物的“系統(tǒng)”行為,而不是“單一組成”的行為。它通過對一個(gè)大系統(tǒng)中包含的所有 蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定、表征和定量,提供關(guān)于該系統(tǒng)準(zhǔn)確和全面的數(shù)據(jù)和信息。蛋白質(zhì)組與基因組通常,一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)兩類基因:必須功能蛋白質(zhì)的基因;行使細(xì)胞專一性功能蛋 白質(zhì)的基因。因此,一種生物有一個(gè)基因組,但有許多蛋白質(zhì)組。因此,蛋白質(zhì)組與基因組 在內(nèi)涵上有很大的不同,主要表現(xiàn)在以下四個(gè)方面:(1) 蛋白質(zhì)組具有多
3、樣性EXON1EXON2EXON1EJU3FU衲EXONZ1 rullranOaEiLrtil2PTTM)啣 Vf iriLjsaujE)圖11.1基因以多種mRNA形式剪接的示意圖EXON :外顯子,真核細(xì)胞基因DNA中的編碼序列。這樣的序列可轉(zhuǎn)錄為RNA并進(jìn)而翻譯為蛋白質(zhì)。 P代表磷酸化,sugar代表糖基化,lipid代表脂肪?;琔b代表泛素化。(2) 在蛋白質(zhì)組的研究中,時(shí)間和空間的影響都不可忽視(3) 蛋白質(zhì)間主要以相互作用的形式參與生命活動(dòng)(4) 蛋白質(zhì)組研究對技術(shù)的依賴性和要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究對生物分析化學(xué)提出的挑戰(zhàn)表11.1目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析中使用的分離與鑒定技
4、術(shù)6-12技術(shù)是否需要標(biāo)記是否可可測定的蛋白質(zhì) 用于分子量范圍動(dòng)態(tài)范圍PTM檢測USA1|:GTPA 卜 -j 5 kD的肽或蛋限于UV檢測,否是1002 500二維色譜系統(tǒng)白質(zhì)未與MS聯(lián)用適用于較復(fù)雜的可 以用LC-MS/MS多維色1415 蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后910蛋白質(zhì)混合物,N /N 標(biāo)記是10, 0009872譜系統(tǒng)(MudPit)的多肽混合物進(jìn)行MS分析前氨基酸需進(jìn)行分級(jí)分離 10 kD,實(shí)際測通過肽質(zhì)量指紋MALDI-TOF-MS否是定蛋白質(zhì)經(jīng)酶解25不適用圖鑒定已分離的后的多肽混合物蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)芯片11對生物樣品中蛋SELDI-TOF-MS 否是v 40 kD25不適用白質(zhì)的質(zhì)量
5、進(jìn)行分析適用于含巰基蛋ICAT以ICAT試劑蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后是無數(shù)據(jù)49612白質(zhì)的相對定量分析技術(shù)標(biāo)記巰基的多肽混合物分析以可裂解的適用于含巰基蛋cICATC /C ICAT蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后分析技術(shù)試劑標(biāo)記巰否的多肽混合物10, 000496白質(zhì)的相對定量基分析注: 2-DE,雙向電泳 (two dime nsional electrophoresis); DIGE,熒光雙向差示凝膠電泳(fluoresce nee two-dime nsio nal differe ntial gelelectrophoresis); MudPit,用于蛋白質(zhì)分離的多維色譜(multi-dimensional
6、for protein identification ); SELDI-MS,表面增強(qiáng)激光解吸離子化一質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption ionization-MS);基質(zhì)輔助激光解吸離子化 一質(zhì)譜(MALDI-MS ,matrix-assisted laser desorption ionization-MS); ICAT,同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽 (isotope-coded affinity tag)技術(shù);cICAT,可裂解的 ICAT ( cleavable ICAT) 技術(shù);PTM,蛋白質(zhì)翻譯后的修飾(posttranslational modifi
7、cation )。A-.蚩白質(zhì)組學(xué)方法的員戦度B:當(dāng)自區(qū)組學(xué)方法釣分耕率圖11.2蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的靈敏度和分辨率13表11.1和圖11.2表明,蛋白質(zhì)組學(xué)研究對生物分析化學(xué)提出了很高的要求:(1) 對含有巨大數(shù)量的多蛋白質(zhì)成分的復(fù)雜體系進(jìn)行全分離是蛋白質(zhì)組學(xué)研究迫切需要解決的問題。(2) 所建立的生物分析化學(xué)分離分析方法應(yīng)具有很寬的動(dòng)態(tài)范圍,才能適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) 組分析的要求。(3) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究對檢測靈敏度也提出了很高的要求。(4) 原位、實(shí)時(shí)檢測。(5) 對蛋白質(zhì)相互作用的檢測是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)非常重要的內(nèi)容,因此,發(fā)展基于 生物化學(xué)的新的、重現(xiàn)性好的蛋白質(zhì)相互作用研究策略也是十
8、分重要的。蛋白質(zhì)組學(xué)的分析策略與研究路線Nit圖11.3蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基本分析策略tl.OW 斡的&.務(wù)肚的MS- MS質(zhì)誥戳據(jù)也數(shù)據(jù)冉中址打搜盍和匹配蛋白質(zhì)組學(xué)的基本分析策略Bnlwin! lb童.略甌向電綠畀H電巻蔓略圖11.4鳥槍法的基本分析策略蛋白質(zhì)組學(xué)的研究路線一條路線類似于基因組學(xué)的研究,即力圖查清人類34萬個(gè)基因編碼的所有蛋白質(zhì),建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,從而獲得有關(guān)生命活動(dòng)的“全景式”信息。另一條是基于比較的研究路線, 稱為比較蛋白質(zhì)組學(xué)(comparative proteomics ),國外的文獻(xiàn)中也有稱為差異顯示蛋白質(zhì)組學(xué)(differential display proteom
9、ics ) 或表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(expression proteomics)。圖11.5比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究路線雙向電泳技術(shù)及其改進(jìn)雙向電泳(two dimensional electrophresis, 2-DE)是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分辨率最高、信息量最大的分離技術(shù)。在比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,雙向電泳還是不可缺少的手段。目前所 應(yīng)用的二維電泳體系是由O Farrell等人于1957年發(fā)明,其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級(jí)屬性(等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量),將一種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行兩次電泳,即:在第一個(gè)方向上按等電 點(diǎn)高低進(jìn)行分離,稱為等電聚焦;在第二個(gè)方向(與第一次電泳成直角的方向)上按相對分 子質(zhì)量大
10、小進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中用得最多的是由固相 pH梯度等電聚焦(immobilized pH gradients isoelectric focusing, IEF)/SDS-PAGE 所構(gòu)成的雙向電泳體系。雙向電泳的流程+- 尊電興桔后的(1承A:為:W向弊|1贏殂屯債“通也樂的術(shù)白M固対氈HI備冃的畀電由豪離儒訊黑上不日前卩H嶽度他.4 ( it即電at*.折的.J?勢在他s和urn申平hef權(quán)粘上的出門威朋吹帶卻開的斷|.盧虺城再聲段蟲BiASOS-PAGE.料!品中的出白虞史白M亞塔般尹的天小切夙冊冨圖11.6雙向電泳流程圖19蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品制備的一般要求一般來說,一種理
11、想的、有效的樣品制備方法應(yīng)滿足以下要求:應(yīng)使所有待分析的蛋 白樣品全部處于溶解狀態(tài)(包括多數(shù)疏水性蛋白),且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性;溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài),避免溶解性低的蛋白質(zhì)(如膜蛋白)在等電聚焦時(shí)由于溶解度降低而沉淀析出;防止在樣品處理過程發(fā)生蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾,包括蛋白質(zhì)降解、 蛋白酶或尿素?zé)岱纸夂笏鸬男揎?;排除核酸、多糖、脂類和其它干擾分子;同時(shí),應(yīng) 避免處理環(huán)境對蛋白質(zhì)的污染;盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白,從而保證待研究蛋白在可檢測水平;盡可能縮短處理樣品的時(shí)間,盡可能在低溫環(huán)境中處理樣品。 雙向電泳圖譜所傳達(dá)的信息由雙向電泳圖可以得到:蛋白質(zhì)的分布范圍
12、(偏酸性或偏堿性);表達(dá)蛋白質(zhì)的可能個(gè)數(shù)(凝膠點(diǎn)的數(shù)目):蛋白質(zhì)的大概相對分子量;蛋白質(zhì)的大概等電點(diǎn);蛋白質(zhì)相對 表達(dá)豐度(點(diǎn)的灰度值)等信息。人血茶的須向電蘇冊圖11.7 雙向電泳例圖23圖像分析技術(shù)圖像分析包括圖像采集、背景消減、斑點(diǎn)配比、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。常用的圖像采集系統(tǒng)有電感偶合裝置(charge coupled devices, CCD)、光密度儀、激光誘導(dǎo)熒光檢測器等。無論何種 采集系統(tǒng),都必須具備透射掃描的功能以獲得較高的靈敏度。圖像采集的信息為光密度值, 一般來說,該光密度值與蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)豐度成正比。影響圖像采集質(zhì)量的因素有:掃描系 統(tǒng)的分辨率、靈敏度,以及掃描時(shí)所選擇的圖像對比
13、度和明亮度。雙向電泳圖像分析通過軟件的運(yùn)行來實(shí)現(xiàn)。軟件分析所要做到的有以下幾點(diǎn):蛋白質(zhì)點(diǎn) 數(shù)的統(tǒng)計(jì);蛋白質(zhì)點(diǎn)的定位、編號(hào);相對豐度分析;在進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析時(shí),則要對相 互對照樣品的凝膠圖像進(jìn)行同步分析,比較對應(yīng)蛋白點(diǎn)的表達(dá)豐度,獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的缺 失、出現(xiàn)以及表達(dá)量的變化等信息。目前有多種圖像分析軟件可以使用,如表11.6所列。表11.6用于2-DE圖像分析的軟件工具軟件名稱來源應(yīng)用FlikerNational Cancer Institute ( / fliker/ )可視的膠-膠對比PDQuestBio-Rad ()
14、凝膠圖像比較Image MsterAmersham Biosciences ()凝膠圖像比較DeCyderAmersham Biosciences ()*2D-DIGE 分析MelanieGenebio (http: / / )凝膠圖像比較Phoretix/ProgenesisNonlinear Dynamics (http: / /)凝膠圖像比較Investigator HT AnalyzerGenomic Solut
15、ions ( http: / / )凝膠圖像比較Proteome WeawerDefiniens (http: / / )凝膠圖像比較Delta 2DDecodon (http: / / )凝膠圖像比較* 2D-DIGE :熒光雙向差示凝膠電泳目前雙向電泳技術(shù)存在的問題(1) 進(jìn)行可完全重復(fù)的 2-DE分析是困難的。(2) 許多較大的疏水蛋白質(zhì)在IEF分析中的結(jié)果不理想。(3) 對相對分子質(zhì)量過大(100, 000)的蛋白質(zhì)分離分析能力差。(4) 雙向電泳不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作,因此,尚
16、不能適應(yīng)大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的需要。(5) 雙向電泳現(xiàn)有的主要染色技術(shù)的檢測靈敏度較差。Ipg 10M a 102 麗 Lmi 10ms JiKimg(IX卩耳卩萬 I於K 10 (IX15*) (1XID1*)K內(nèi)用Eq卻細(xì)審融)L一里門計(jì)畝號(hào)歐嘉JT口廉皓+芷a二-.圖11.8目標(biāo)蛋白拷貝數(shù)與膠上荷載的由細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)量的關(guān)系24雙向電泳技術(shù)的改進(jìn)目標(biāo)主要有兩個(gè):提高分辨率,增加可分離的蛋白點(diǎn)的數(shù)目;提高低豐度蛋白點(diǎn)的 可檢出程度。 11.4. 5. 1三步提取法打411 SW%JK IU.i( HAPSiTris. Tftk上帶湫進(jìn)和HD詼離據(jù)垠議J(mlhjiJvmClfAFSSBJr
17、-ICiTrii BdLvbe-yTBPr:林進(jìn)f A。!:分髙當(dāng)i%圖11.9三步提取法流程圖 11.4. 5. 2亞細(xì)胞器分離優(yōu)點(diǎn)為:增加了蛋白的點(diǎn)分離數(shù)量;可提高低豐度蛋白的檢出;可明確蛋白點(diǎn)的 亞細(xì)胞定位。圖11.10肝癌細(xì)胞QGY-7703全細(xì)胞及細(xì)胞核、20000 g沉淀、100, 000 g沉淀、細(xì)胞質(zhì)的雙向電泳圖熒光雙向差示凝膠電泳技術(shù)(fluoresce nee two-dime nsional differe ntial gel electrophoresis , 2-DDIGE)2-D DIGE是由Amersham公司開發(fā)的一種改良技術(shù)。它在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ) 上,結(jié)
18、合多重?zé)晒夥治龅姆椒?,在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光染料標(biāo)記的樣品。在2-D DIGE技術(shù)中,每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo),并且軟件全自動(dòng)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn),保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。這種技術(shù)可檢測到樣品間小 于10%的蛋白表達(dá)差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95%以上。3林記時(shí)用樣扁處理樣品時(shí)光掃描表達(dá)義并圖11.112-D DIGE的實(shí)驗(yàn)流程圖蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的色譜技術(shù)及幾種分離技術(shù)的“雜交”多維液相色譜技術(shù)多維液相色譜(multidimensional HPLC ,MDLC)技術(shù)是指連續(xù)使用幾種液相色譜分離模 式以使復(fù)雜混合物中的成分得到更大程度的分離的色譜技術(shù)
19、。與2-DE相比,多維液相色譜的主要優(yōu)點(diǎn)為:有高的選擇性,能從含多種未知組分、組 成復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品中分離出需要的組分;對于低豐度成分有很好的富集和檢出能力; 易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作,分析數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。二維液相色譜的基本操作流程是:樣品在經(jīng)過的基礎(chǔ)上,利用高壓切換閥,把譜圖中的 某個(gè)色譜峰(混合組分峰)的一部分(或全部)選擇性地切換到二維色譜柱上進(jìn)行再次分離。 常采用的二維液相色譜分離模式有:離子交換色譜-反相液相色譜、色譜聚焦-反相液相色譜、分子排阻色譜-反相液相色譜、親和色譜-反相液相色譜等。開展工柜I KIJ %總hi椎色iwm分帆akj.uri3F.wxfii圖11.12酵母可溶性蛋白提取
20、物的MDLC分析幾種分離技術(shù)的“雜交”蛋白質(zhì)混合物通過制備 IEF、制備1D-SDS-PAGE或HPLC (如親和色譜)分離整體蛋白 質(zhì)混合物,然后對分離得到的組分進(jìn)行酶解,所產(chǎn)生的肽在進(jìn)入MS前進(jìn)行HPLC分離。這種策略的優(yōu)點(diǎn)在于:利用電泳技術(shù)或HPLC技術(shù)對整體蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行前端處理的樣品量較大,可以達(dá)到若干毫克。去除與分析目標(biāo)不相關(guān)的蛋白質(zhì),提高M(jìn)S檢測低豐度組分的能力。生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中,生物質(zhì)譜可以開展三個(gè)方面的基礎(chǔ)工作:(1 )以MALDI-TOF-MS 或ESI-MS精確測定完整蛋白質(zhì)或肽的相對分子質(zhì)量;(2)以MALDI-TOF進(jìn)行肽質(zhì)量指紋
21、譜的測定,這是利用質(zhì)譜測定由一種蛋白質(zhì)酶解出的一 組肽產(chǎn)物的技術(shù);(3)以ESI-MS/MS或ESI-Q-TOF-MS進(jìn)行肽序列的分析,這是測定一種蛋白質(zhì)酶解出的一 組肽產(chǎn)物中一種(或多種)肽的質(zhì)量碎片譜圖的技術(shù)。精確測定完整蛋白質(zhì)或肽的相對分子質(zhì)量MALDI-TOF-MS 測定相對分子質(zhì)量(1)MALDI-TOF-MS測定相對分子質(zhì)量使用線性模式或反射模式。(2)MALDI-TOF-MS對分析樣品的要求。(3)MALDI-TOF-MS分析中的基質(zhì)選擇。(4)MALDI-TOF-MS分析中的質(zhì)量校正。表11.8肽質(zhì)量準(zhǔn)確度與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果*分子離子誤差(ppm)匹配蛋白質(zhì)數(shù)所有種類a酵母
22、b1975.954100075417310020076104461562.884100098212010019727101921055.541100013001731005147610876* 通過 http : /prospector, 網(wǎng)址用MS-FIT程序進(jìn)行檢索a:所有種類蛋白質(zhì)為 52, 205個(gè);b:酵母蛋白質(zhì)為3653 個(gè)ESI-MS測疋相對分子質(zhì)量在ESI條件下,能與多肽或蛋白質(zhì)分子結(jié)合的質(zhì)子數(shù),也就是正電荷數(shù),由分子中所含堿性氨基酸(ARG , LYS , HIS )總數(shù)和N-端氨基決定。蛋白質(zhì)和多肽形成多電荷離子的特 性使分析質(zhì)量范圍在 24 kDa( m/
23、z)的四極桿和離子阱質(zhì)量分析器可用于生物大分子的分離。ESI-MS圖不能直接獲得蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量信息,必須通過一個(gè)重組的過程,即用計(jì)算機(jī)軟件處理多電荷譜圖的原始數(shù)據(jù),求算相對分子質(zhì)量。常用的是Mann等建立的“平均算法” 34。該算法利用蛋白質(zhì)正離子的ESI-MS譜計(jì)算其相對分子質(zhì)量是基于兩個(gè)假定:在一個(gè)多電荷離子系列中,相鄰峰值相差1個(gè)電荷;電荷是由于陽離子的加成(通常為質(zhì)子)所致。顯然,多電荷譜圖的的分辨率越高,重組所得的結(jié)果越準(zhǔn)確。為了保證重組結(jié)果 的可靠性,還需注意:用于計(jì)算的多電荷峰的分布形狀:隨著電荷的減少,由低豐度向高 豐度再向低豐度變化;該算法需要有至少4個(gè)以上的多電荷離子
24、方能保證其準(zhǔn)確。表11.10幾種蛋白質(zhì)的多重電荷數(shù)蛋白質(zhì)分子量濃度(卩mol L -1)電荷數(shù)質(zhì)量范圍(m/z)胰島素5, 7301.74 69501,450細(xì)胞色素12, 4001.3512 21550 1, 100溶菌酶14, 3000.3510 131, 100 1, 500肌紅蛋白17, 00029.51627600 1, 100a -糜蛋白酶原A25, 70019.017221, 100 1, 500乙醇脫氫酶39, 80012.532 468001,300a -淀粉酶54, 7001.835 588801,550伴清蛋白176, 0000.2249 641,200 1, 500圖1
25、1.13 溶菌酶的ESI-MS質(zhì)譜圖右上角的小圖是溶菌酶的多電荷離子質(zhì)譜圖,大圖是經(jīng)“去卷積”數(shù)據(jù)處理的重組質(zhì)譜圖,溶菌酶的相對分子質(zhì)量為14, 305.7。從重組譜圖中可以看出,該分子質(zhì)量峰有一定的寬度,這是由于同位素峰的影響造成的。用肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprinting,PMF )是指蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜,由于其具有特征性,所以稱為指紋譜。PMF可用于蛋白質(zhì)的鑒定,即用實(shí)驗(yàn)測得的蛋白質(zhì)酶解肽段質(zhì)量數(shù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索,尋找具有相似肽指紋 譜的蛋白質(zhì)。肽質(zhì)量指紋譜的基本實(shí)驗(yàn)步驟肽質(zhì)量指紋譜的基本實(shí)驗(yàn)步驟
26、包括:2-DE膠上切下需要鑒定的未知蛋白點(diǎn),脫色;酶切;肽提取及 MALDI-TOF質(zhì)譜分析;數(shù)據(jù)庫檢索、鑒定蛋白質(zhì)。來巾皆DE的未知蛍白點(diǎn)煥逸僵白VIVMMAV4 W2MVU M 2 MU1比對昇片股井子量郵確窪譙黃白質(zhì)身井圖11.14用肽質(zhì)量指紋圖鑒定蛋白質(zhì)的基本流程圖1 1 Jr na/iM ALDI-TDF 悟或 ESi-isflr 析為到 pwPMF分析中所用的蛋白酶在PMF分析中,使用蛋白酶的目的是盡可能多的獲得合適長度的肽片段供MS分析。含有620個(gè)氨基酸殘基的肽片段適合于MS分析和數(shù)據(jù)庫比較。氨基酸殘基少于6個(gè)的肽太短,不能在數(shù)據(jù)庫檢索中產(chǎn)生唯一的序列匹配;而氨基酸殘基多于20
27、個(gè)的肽,難以獲得序列信息。對用于PMF的酶的一般要求是:易得,純度高,穩(wěn)定性好,為提高 PMF檢索數(shù)據(jù)庫的 準(zhǔn)確性,產(chǎn)生肽譜的酶切點(diǎn)至少要有兩個(gè)。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中,常用的酶有胰蛋白酶和Glu-C。PMF的數(shù)據(jù)庫檢索PMF所提供的是蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后所得到的肽混合物的精確質(zhì)量數(shù)據(jù),要完成蛋白質(zhì)的鑒 定,還需要利用這些數(shù)據(jù)通過數(shù)據(jù)庫檢索尋找匹配的蛋白質(zhì)。開展數(shù)據(jù)庫檢索的基礎(chǔ)是: 數(shù)據(jù)庫的選擇;肽質(zhì)量指紋譜軟件工具的選擇與利用。常用的軟件有 Mascot, Peptide Search,MS-fit , ProFound 等。影響PMF結(jié)果的因素(1 )靈敏度。(2)可檢測到的肽段少,對數(shù)據(jù)庫檢索是不
28、利的。(3 )精確度。(4) 質(zhì)量校正是實(shí)驗(yàn)中必不可少的一步,尤其是對TOF質(zhì)量分析器,質(zhì)量校正非常重要而且需常規(guī)進(jìn)行。(5 )分辨率。(6 )數(shù)據(jù)庫。(7)樣品制備。用串聯(lián)質(zhì)譜分析肽序列和鑒定蛋白質(zhì)PMF是鑒定蛋白質(zhì)的一種簡單、可行的分析策略,在目前的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中,許多工 作可以通過這一策略來完成。例如,人血紅蛋白 a鏈的胰蛋白酶消化產(chǎn)生14個(gè)胰蛋白酶酶解肽,其中,序列為VGAHAGEYGAEALER 肽的M+1 +單同位素精確質(zhì)量(m/z)為1529.734 8,而來自小鼠的 血紅蛋白a鏈的IGGHGAEYGAEALER肽有4個(gè)氨基酸與之不同, 其M+1 +單同位素精確質(zhì) 量也是152
29、9.34 8,PMF技術(shù)沒有能力對這種序列的不同加以辨認(rèn)。因此,對于難以通過 PMF得到滿意結(jié)果的,則需要通過ESI-MS/MS分析來進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。ESI-MS/MS測序的關(guān)鍵步驟是在多肽一級(jí)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上,選擇母離子(pare nt ion),通常是(M+H) +或(皿+門巴n+離子,使之進(jìn)一步發(fā)生解離,得到更小的碎片離子,根據(jù)碎片離子之間 的質(zhì)量差來“拼接”、“復(fù)原”肽類分子的構(gòu)成,從而進(jìn)行氨基酸序列的推測。碎片離子的產(chǎn)生模式產(chǎn)生碎片離子常采用碰撞誘導(dǎo)解離( collision induced dissociation , CID)、碰撞活化解離(collision active dis
30、sociation ,CAD )、源后衰變(post-source decay, PSD)等模式。MS/MS中的肽離子裂解11IH單IN卑子-Stiff 錚析屮件壯丼井子St主單巾產(chǎn)主JE小曲離石if片.離尸辟片4:.圖 11.15串聯(lián)質(zhì)譜CAD分析示意圖的開裂II Cl I-CcanoNH-CI1-C-UIL圖11.16肽的串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子示意圖蛋白質(zhì)多肽主鏈開裂的主要方式有三種,即:a/x、b/y和c/z的成對出現(xiàn)。一般而言,b/y開裂產(chǎn)物的豐度較高,a/x開裂在許多蛋白質(zhì)的開裂中也占有主導(dǎo)地位,而c/z開裂則較少出現(xiàn)。N端的片段,y離子是電荷b離子和相應(yīng)的y離子。(1) 酰胺鍵斷裂,形成
31、 b離子、y離子。b離子是電荷保留在保留在C端的片段。當(dāng)母離子帶有雙電荷時(shí),有可能產(chǎn)生一系列正離子Jffi齟散b島子汕子8?.1SPAFDSliXrAETLF 比討1J2J.A185.SFhjAFD5ILklLTLf1226.4256.3SPAFUSBIAEILF :巧Jn5.4SSPAFDMAETLFT*11SPAFD$BIAETir 鈕Jz1645.點(diǎn)SFAFDS佝】B1AETLF g0SSPAFDy(Ih,)MAETEF 如JI側(cè).0SPAFDSBIgAETL F g.7911.1sPArosnugETLF gWMb3O50.2SPAFDSBMAE啊丿TLF知Jfi.5im.SSPAFD
32、SBIAETLF yp4I26J4SPAiTOSilMrAETLF(V,)1417.2圖11.17 帶有雙電荷的SPAFDSIMAETLF 2+可能產(chǎn)生的b、y離子系列(括號(hào)內(nèi)為離子片斷的質(zhì)量數(shù))(2) 羰基碳原子與相鄰的a碳原子間的C-C鍵斷裂,形成a離子、x離子。a離子是電荷 保留在N端的片段,x離子是電荷保留在 C端的片段。(3) 酰胺氮原子與相鄰的a碳原子間的N-C鍵斷裂,形成c離子、z離子。c離子是電荷 保留在N端的片段,z離子是電荷保留在 C端的片段。通過MS/MS進(jìn)行肽序列分析的基本原理在目前的MS/MS分析中,主要是根據(jù)完整或互補(bǔ)的y、b離子系列來確定肽的序列。用ESI-MS/
33、MS譜圖鑒定蛋白質(zhì)的策略(1) 串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋策略(2) de Novo 策略(3) 肽序列標(biāo)簽(peptide sequenee tags PSTs)策略T 二二丄*7IS.8 S-M.O 9M.I I0MI.2|i!1執(zhí)庠附質(zhì)捷*圖11.18肽序列標(biāo)簽示意圖肽序列標(biāo)簽是由一個(gè)肽段的分子量、該肽段的部分氨基酸序列、該肽段未測序前部分和測序后部分的質(zhì)量組成表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)( surfaee-enhanced laser desorption/ionization time-of-?ight mass spectrometry , S
34、ELDI-TOF-MS )是在 MALDI-TOF-MS 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 一種有效的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)。這一技術(shù)最早由德國科學(xué)家Lueking等開始研究,美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystem Inc.)進(jìn)行了系統(tǒng)研發(fā),對 MALDI-TOF-MS 技術(shù)所使用的 疏水性樣品板表面進(jìn)行了系統(tǒng)的改進(jìn),發(fā)展成為蛋白質(zhì)芯片(proteinchip arrays )系列。蛋白質(zhì)芯片的種類與特點(diǎn)分為化學(xué)表面芯片(chemical surfaces protein expression profiling )和生物表面芯片(biochemical surfaces prote in in teract ion assays )兩大類?;瘜W(xué)表面芯片化學(xué)表面芯片是基于色譜的原理設(shè)計(jì)的,即將色譜介質(zhì)鋪于芯片材料表面,形成一個(gè)特 殊的物理化學(xué)表面,通
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