酶在食品分析中的應用(2)課件

1、酶在食品分析中的應用(2)1 主要內容：主要內容： 酶在食品分析中的應用(2)2 酶法分析的發(fā)展酶法分析的發(fā)展 n酶在定量分析中的應用可以追溯到19世紀中期。 當時，曾采用麥芽提取物作為過氧化物酶源， 以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測定過氧化氫。 n然而，酶法分析真正的發(fā)展應歸于它在臨床實 驗室中的廣泛應用。 酶在食品分析中的應用(2)3 酶法分析的發(fā)展酶法分析的發(fā)展 n如早在1914年臨床上就開始采用脲酶測定尿中 的尿素，但是在臨床實驗室中酶分析的真正突 破要推遲到1958年，當時轉氨酶分析發(fā)展成為 診斷肝病和心臟病的一個有效手段。 n到了20世紀50年代前已有60種物質能借助于酶 法分析。近

2、年來，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應 用于臨床檢驗、食品、環(huán)境等生物及其它樣品 的檢測。 酶在食品分析中的應用(2)4 1. 酶法分析的特點及應用類型酶法分析的特點及應用類型 n酶的特性酶的特性n酶法檢測的特點酶法檢測的特點 催化效率高 專一性 靈敏性強 快速 特異性、準確 不需要物理分離，干擾少 酶在食品分析中的應用(2)5 酶在食品分析中的應用類型酶在食品分析中的應用類型 n1）去除樣品中的雜質。如測定果糖、多糖等。 n2）催化待測物生成新的產物，而這種產物更容 易被定量分析。如：淀粉的測定。 n3）測定食品中酶的活性作為食品的指標，如過 氧化物酶的測定、蜂蜜中酶的測定。 n4）利用酶催化反應所

3、產生的一些信息。如酶聯(lián) 免疫法、酶電極法等。 酶在食品分析中的應用(2)6 2 酶聯(lián)免疫測定（ELISA） n酶聯(lián)免疫測定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）是繼放射免疫測定技術之后發(fā) 展起來的一項新的免疫學技術。 nELISA自上世紀70年代出現(xiàn)開始，就因其高度 的準確性、特異性、適用范圍寬、檢測速度快 以及費用低等優(yōu)點，在臨床和生物疾病診斷與 控制等領域中倍受重視，成為檢驗中最為廣泛 應用的方法之一。 酶在食品分析中的應用(2)7 2.1 ELISA的的基本原理 n（1）利用抗原與抗體的特異反應將待測待測 物與酶連接（或建立關聯(lián)）物與酶連接（

4、或建立關聯(lián)）。 n（2）通過酶與底物產生顏色反應，用于 定量測定。 n它將酶促反應的高效率酶促反應的高效率和免疫反應的高度專免疫反應的高度專 一性一性有機地結合起來，可對生物體內各種微 量有機物的含量進行測定。測定的對象可以 是抗體也可以是抗原。 重點重點 酶在食品分析中的應用(2)8 ELISA試劑盒的組成試劑盒的組成 n完整的ELISA試劑盒包含以下各組分： （1）包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑免疫吸附劑）； （2）酶標記的抗原或抗體（標記物標記物）； （3）酶作用的底物（顯色劑顯色劑）； （4）陰性和陽性對照品（定性測定），參考標準 品和控制血清（定量測定）； （5）結合物及標本的

5、稀釋液； （6）洗滌液；（含吐溫20磷酸鹽緩沖液） （7）酶反應終止液。（常用硫酸） 必需必需 酶在食品分析中的應用(2)9 酶標儀和酶標板酶標儀和酶標板 DNM-9602ADNM-9602A酶標分析儀酶標分析儀 酶標板酶標板 酶在食品分析中的應用(2)10 2.2 ELISA2.2 ELISA的基本類型的基本類型 n隨著ELISA在生物檢測分析領域的廣泛應用， 根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體 條件，逐漸演變出了幾種不同類型的檢測方法： （5）捕獲法測IgM抗體； （6）ABS-ELISA法； （7）PCR-酶聯(lián)免疫測定法； （8）斑點免疫酶結合試驗。 （1）夾心法；）夾心法； （2

6、）間接法；）間接法； （3）競爭法；）競爭法； （4）雙位點一步法； 酶在食品分析中的應用(2)11 雙抗體夾心法 n此法常用于測定抗原此法常用于測定抗原, , 將已知抗體吸附于固相將已知抗體吸附于固相 載體載體, , 加入待檢標本加入待檢標本( (含相應抗原含相應抗原) )與之結合。與之結合。 溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。 （1）雙抗體夾心法）雙抗體夾心法 乙肝表面抗原。 酶在食品分析中的應用(2)12 間接法 n此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸 附于固相載體，加入待檢標本附于固相載體，加入待

7、檢標本( (含相應抗體含相應抗體) )與與 之結合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體之結合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體( (酶酶 標抗抗體標抗抗體) )和底物進行測定。和底物進行測定。 （2）間接法）間接法ELISA 酶在食品分析中的應用(2)13 競爭法 n此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測 定抗體。以測定抗原為例定抗體。以測定抗原為例, , 將抗原吸附于固相載體；將抗原吸附于固相載體； 加入待測抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與加入待測抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與 待測抗原二者競爭與抗體結合；經過洗滌分離，最待測抗原二者競爭與抗

8、體結合；經過洗滌分離，最 后結合于固相的抗體與待測抗原含量呈負相關。后結合于固相的抗體與待測抗原含量呈負相關。 （3）競爭法）競爭法 黃曲霉素 酶在食品分析中的應用(2)14 2.3 ELISA測定中酶的作用測定中酶的作用 n由于酶的催化效率很高，間接地放大放大了免疫反 應的結果，使測定具有極高的靈敏度。 酶在食品分析中的應用(2)15 （1）酶標記的抗體或抗原的制備）酶標記的抗體或抗原的制備 n酶標記的抗體或抗原是ELISA中最關鍵的試劑。 良好的結合物既保持了酶的催化活性，也保持 了抗體或抗原的免疫活性。 n酶標記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法和過碘過碘 酸鹽氧化法酸鹽氧化法兩種

9、方法。酶結合物一般需經離子 交換層析或分子篩分離純化。 酶在食品分析中的應用(2)16 （2）常用的酶及底物）常用的酶及底物 酶酶 底底 物物顯色反應顯色反應 測定波長測定波長 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺 氨基水楊酸氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺 2,2-2,2-連胺基連胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻唑啉磺酸并噻唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色 黃色黃色 棕色棕色 蘭色蘭色 藍綠色藍綠色 492492 460460 449449 425425 642642 堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(PNP)(

10、PNP) 萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸鹽磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色 紅色紅色 400400 500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色 藍色藍色 405405 420 420 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG) 硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 熒光熒光 黃色黃色 3 6 0 , 4 5 03 6 0 , 4 5 0 420420 為什么辣根過氧化物酶可應用于為什么辣根過氧化物酶可應用于elisa

11、？ 酶在食品分析中的應用(2)17 為什么辣根過氧化物酶可應用于為什么辣根過氧化物酶可應用于elisa？ n（1）成本低 n（2）熱穩(wěn)定性好 n（3）顯色反應類型多 酶在食品分析中的應用(2)18 2.4 ELISA技術在食品分析中的應用技術在食品分析中的應用 n近年來，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡單化 和檢測的高靈敏性，在農藥殘留、獸藥殘留、 重要有機物污染、生物毒素、食品添加劑和人 畜共患疾病病原體的快速檢測和分析等食品安 全性檢測領域正逐步推廣應用。 酶在食品分析中的應用(2)19 （1）毒素檢測 n真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物，其中的 十幾種對人類危害較大，它們一般同時具有毒

12、 性強和污染頻率高的特點。其中毒性最大、致致 癌能力最強癌能力最強的是黃曲霉毒素。它在自然界中分 布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在 一起，生長在糧食、油料作物的種子、各種食 品和飼料中。 酶在食品分析中的應用(2)20 n自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世至今，幾 乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、 玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉 素等的ELISA 檢測方法均已建立。 n在對黃曲霉素B1(AFT B1)的檢測中，其檢測 AFT B1的線性范圍0.255.Og/mL，靈敏度為 12.5 Pg，整個測定過程僅為4h。另外該方法 也正在被廣泛地應用于各種藻類和貝類毒素的

13、檢測。 酶在食品分析中的應用(2)21 黃曲霉素B1 ELISA試劑盒 n本試劑盒包括用于定量檢測黃曲霉素B-G的試 劑和方法。 n檢測數(shù)量：96孔（包括標準） n檢測時間：20分鐘 酶在食品分析中的應用(2)22 金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測 n蘑菇罐頭約占我國罐頭出口量的30，中國蘑菇罐頭一 度占據(jù)美國市場2/3份額，1989年以來FDA以我國蘑菇罐 頭食品含有金黃色葡萄球菌腸毒素并導致消費者傷害為 由，對中國蘑菇罐頭采取”自動扣留措施”。2002年才 得以解決。 nFDA檢測蘑菇罐頭葡萄球菌腸毒素使用的TECRA試劑盒 在檢測過程中會產生強烈的非特異反應，因此，這

14、種試 劑盒是不可靠的，其所得出的檢測結果也是不可靠的。 酶在食品分析中的應用(2)23 （2）農藥殘留檢測 n酶聯(lián)免疫測定已成為許多國際權威分析機構如 AOAC分析農藥殘留的首選方法。迄今為止， 應用酶聯(lián)免疫測定檢測食品中的殘留農藥主要 為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA 檢出下限為0.07g/mL，與色譜法測定的結果 一致。 酶在食品分析中的應用(2)24 n從目前來看，盡管ELISA檢測限度還不能完全 達到國外發(fā)達國家技術法規(guī)和限量標準的要求， 而且抗體制備不易和不能同時完成多種農藥殘 留檢測等缺點，但是由于該技術具有樣本前處 理簡單，純化步驟少，大量樣本分析時間短， 適合于做成

15、試劑盒現(xiàn)場篩選適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點，使其可在 蔬菜產區(qū)、蔬菜批發(fā)市場和海關配備，工商人 員可隨身攜帶或建立固定的農藥殘留速測點， 隨時把殘毒超標的蔬菜、水果杜絕在食用之前。 酶在食品分析中的應用(2)25 （3）細菌污染檢測 n食品中的有害細菌數(shù)量達到一定數(shù)目， 食用后會引起各種疾病。為了有效地控 制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測 方法。目前有許多種方法，其中通過制 備單克隆抗體分析食品中細菌的酶聯(lián)免 疫測定技術研究最多，檢測結果準確可 靠。 酶在食品分析中的應用(2)26 沙門氏菌的沙門氏菌的ELISA檢測 n例如對沙門氏菌最低檢測量可達500CFU/g，僅 需22h，比常規(guī)方法

16、縮短了34 d，與金黃色 葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應。此外以 ELISA技術為基礎的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng)，技術為基礎的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng)， 實現(xiàn)了整個過程的自動化，全程耗時僅為實現(xiàn)了整個過程的自動化，全程耗時僅為 45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬 片的內面，可以從前增菌液中吸附被檢的沙門 氏菌，對于該系統(tǒng)來說，需要做的只是加樣。 酶在食品分析中的應用(2)27 李斯特氏菌的快速檢測李斯特氏菌的快速檢測 n在對李斯特氏菌的快速檢測中，利用三株針對 單核細胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和 西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗，以夾心 ELISA法，在48h內，可從人工模擬肉中檢測

17、下 限為5CFU/g樣品。 酶在食品分析中的應用(2)28 （4）肉類品質檢測）肉類品質檢測 n ELISA在肉類食品品質檢測中的應用主要包括 加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測兩個方 面。腸道疾病的爆發(fā)和動物性食品有很大關系， 而肉食品加熱煮制不當是引起該疾病爆發(fā)的一 個主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會 降低，而一些產物的濃度會提高。 酶在食品分析中的應用(2)29 n當用蛋白質做指示劑時，可制備抗體，這種抗 體對單一蛋白質的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有 專一性，這樣它就可以指示蛋白質在加熱過程 中變化。因而ELISA可作為商業(yè)上快速判定分 析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對目前用的

18、最多的是對 乳酸脫氫酶的免疫檢測乳酸脫氫酶的免疫檢測。其次是對摻入異種肉 的檢測，利用多克隆抗體對血清白蛋白的酶聯(lián) 免疫測定法，對鮮肉進行摻假檢測。 酶在食品分析中的應用(2)30 n幾種以單克隆抗體為基礎的ELISA反應已得到 應用，可以檢測出1%2%的摻假率。目前在 商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測定已可以檢測十多種動物 肉，該方法已為美國農業(yè)部使用。同時， ELISA技術也可以利用對熱穩(wěn)定的肌肉抗原來 檢測加熱處理后的肉摻假情況。目前，該技術 可以檢測6種家畜熟肉制品。 酶在食品分析中的應用(2)31 （5）動物性食品中藥物殘留檢測 n利用ELISA技術測定動物性食品中有害殘留成 分只是近幾年的事。隨

19、著研究的深入，由原樣 品的復雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過 程，加速了其在實際檢測中的應用。特別是對 豬肉、禽肉和水產品中重要禁用獸藥的檢測。 酶在食品分析中的應用(2)32 n如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測法， 基于抗原抗體反應進行競爭性抑制測定，不僅 可作為一個定性篩選過程，也可以進一步進行 定量測定。檢測靈敏度可達到0.510-9，完全 達到我國農業(yè)部目前的110-9監(jiān)督檢測標準。 ELISA法作為鹽酸克倫特羅殘留量的篩選方法具 有操作簡便、準確快速的特點，適用于大量樣 品的測定，并可能成為國家標準檢測方法。 酶在食品分析中的應用(2)33 （6） 人畜共患疾病病原體檢測 n在

20、禽流感病毒檢測方面，我國已完成了禽流感 流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷 抗原的研制及應用，建立了禽流感免疫酶診斷 方法和技術，已形成試劑盒生產能力。此外， 采用ELISA法可以有效檢測牛及羊朊病毒蛋白， 該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種 致死性神經系統(tǒng)疾?。ǒ偱２?，BSE），與人 群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關。 酶在食品分析中的應用(2)34 （7） 重金屬污染檢測 n金屬硫蛋白遍存于自然界，細菌、植物、動物 以及人類肌體中，是一類對重金屬離子有很強 親和力，含豐富的半胱氨酸（約1/3），不含 芳香族氨基酸和組氨酸的低分子量蛋白質。金 屬硫蛋白含有大量的-SH，能與H

21、g、Cd、Cu、 Ag等重金屬離子結合掩蔽金屬的毒性，對細胞 內的金屬離子有重要的解毒作用。 酶在食品分析中的應用(2)35 n生物細胞，在環(huán)境受重金屬污染（Cu、Hg、 Cd、Pb、Zn與金屬離子）的情況下，可被誘導 合成出大量的金屬硫蛋白，且在一定范圍內成 正比，是一項對金屬污染具特異性的指標。用 純化的金屬硫蛋白對兔進行免疫，兔抗血清純 化后并標記辣根過氧化酶，可實現(xiàn)對食品中重 金屬污染的超微量檢測。 酶在食品分析中的應用(2)36 （8） 食物中其它成分檢測 nELISA技術同時可以用于食品中其它成分的檢測， 如:(1)檢測某些特定的轉移基因表達蛋白，以 分析食品是否來自轉基因生物或者

22、含有轉基因 成分；（2）食品中營養(yǎng)素的測定，最小檢出限 可達0.05g/g；（3）通過合成不同異黃酮的羥 酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4） 可用于檢測食品加工過程中的酶（如磷酸丙糖 異構酶和轉谷氨酰胺酶）含量的變化等。 酶在食品分析中的應用(2)37 酶在食品分析中的應用(2)38 PCR檢測的原理檢測的原理 n聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）以特定的基因片段 為模板，利用人工合成的一對寡聚核 苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸為底 物，在DNA聚合酶的作用下，通過 DNA模板的變性，達到基因擴增的目 的。PCR是目前轉基因食品檢測較是目前轉基

23、因食品檢測較 為成熟的方法。為成熟的方法。 酶在食品分析中的應用(2)39 n我國已應用PCR- 酶聯(lián)免疫測定檢測技術，建 立了轉基因大豆與玉米中常用外源基因的快速 檢測體系，并應用于進出境產品的轉基因檢測 實際工作中，結果表明，PCR-酶聯(lián)免疫測定法 具有操作簡便、靈敏特異、結果準確的優(yōu)點， 可對轉基因大豆、玉米及其它轉基因產品進行 定性和定量檢測。 酶在食品分析中的應用(2)40 PCR檢測的應用檢測的應用 n對熱處理后的熟肉樣品，要檢測出肉制品中肉的 組成比較困難，但經PCR后檢測，牛肉、豬肉、 雞肉和火雞肉的最小檢測量可以達到1%2 %， 而且肉制品中的抗壞血酸添加劑不影響檢測結果。

24、目前，PCR是區(qū)分雞肉和火雞肉的唯一方法。 PCR也用于食品中腐敗菌、病原菌如腸道出血性 大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、金黃色葡萄球菌等 的檢測。 酶在食品分析中的應用(2)41 n酶傳感器主要利用它對生物體的催化特性，且對特 定底物有反應的特異性，把這種特異性與電化學分電化學分 析的迅速性和簡便性析的迅速性和簡便性結合起來，從含有多種多樣有 機物的生物試樣中，有選擇地把特定物質迅速測定 出來。 酶在食品分析中的應用(2)42 C6H12O6 + O2 C6H12O7 + H2O2 酶在食品分析中的應用(2)43 酶傳感器的優(yōu)點酶傳感器的優(yōu)點 n它還具有能反復進行，不需要通常進行酶分析 時需要的酶

25、和顯示劑，實現(xiàn)無試劑分析實現(xiàn)無試劑分析，因此， 發(fā)展較快，現(xiàn)已有多酶傳感器，可用在生產線 上監(jiān)控食品加工流程、發(fā)酵工藝過程及微生物 濃度的控制，又可在包裝材料上測知食品是否 經過不當溫度的貯存經過不當溫度的貯存，冷凍時微生物含量及貯 存壽命的預警。 酶在食品分析中的應用(2)44 n利用酶電極進行食品分析，已能測定多種氨基酸和 一些糖類，如：用脲酶電極法測定食品中賴氨酸含 量。由固定化蔗糖轉化酶、葡萄糖變旋酶及葡萄糖 氧化酶的復合酶膜組成的過氧化氫雙電極系統(tǒng)，可 同時測定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量，具有操作簡 單，測定快速，結果準確可靠，儀器穩(wěn)定性好，酶 膜使用壽命長的特點，一次進樣可同時測定樣品中 蔗糖和葡萄糖的含量，而且樣品無需特別處理。該 方法適用于食品發(fā)酵液中蔗糖和葡萄糖的測定。 酶在食品分析中的應用(2)45 酶電極在食品行業(yè)中的應用酶電極在食品行業(yè)中的應