WB實驗基本步驟

1、實驗基本步驟提取細胞蛋白JBCA定量J制備蛋白膠(S D S-PAGE交)J蛋白樣品變性J電泳J轉膜J封閉J一抗JT BS T洗滌J二抗JTBST洗滌J顯影J結果分析試劑配制Io PBS磷酸鹽緩沖溶液1L磷酸二氫鉀0、 24g磷酸氫二鈉1.44 g氯化鈉8 g氯化鉀 0 o 2g加入50 0 ml純水,調PH=7、2定容至 1L, 高壓蒸汽滅菌2o PBST（PBS+ 0、05% 吐溫一2 0 ）50 0 ml PBS+0 2 5ml 吐溫-2 03。電轉液 500 mlT ris1。5g甘氨酸7 o 2 g4 0 0m l水溶解加入100ml甲醇,置于4C冰箱預冷4 .電泳液（1 X ）1

2、0 x稀釋，5 0m 11 0x電泳液+450ml純水5.TBS6 o TBST（TB S +0。05% 吐溫一20）5 0 m 1T BS+ 4 50 m 1 純水 +0.25m1 吐溫-2 07、封閉液TBS T1X +5 % 奶粉4 0 ml封閉液=4 0 mITBST +2 g奶粉,40 C預熱W B實驗一、蛋白樣品制備準備:一管細胞,PBS （ 4C預冷）,PMSF（10 0m M）,移液槍（1 0 00uI, 1 0ul）,1、5m IEP管2個,高速冷凍離心機 4C 預冷1于一2 0C冰箱中取出一管細胞樣品，吸去培養(yǎng)液2加入1m 1 4C預冷得PBS（0 0 1 M pH727、

3、 3）。用移液槍輕輕吹成懸浮液后4C , 8 00 0 r離心5 m in,然后棄去上清、重復以上操作一次，共洗細胞兩次以洗去培養(yǎng)液。3、按1ml裂解液加10卩I P MSF （100 mM）,搖勻置于冰上。（P MSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）4 在樣品中加入3 0 0 ul含PM S F得裂解液，吹勻，于冰上裂解30 mi n,為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來 回搖動、5.裂解完后，于4C下1 2 000 rpm離心5 mi n。7.將離心后得上清分裝轉移倒0。5 ml得離心管中放于20C保存、二、蛋白含量得測定（BCA定量）準備:96 孔板,移液槍（10 0 0u 1 ,10ul

4、, 2 00ul）, B CA 工作液（A+B ）, 5 0 ml E P 管,1 xPB S,BS A標準液1將9 6孔板分好區(qū)域，若不夠分則只做兩個重復，（外圍一圈得孔最好不用）2算好孔數（總得）每孔加2 0 0 u lBCA工作液（A +B）,（A液:B液=50:1, 一般配多些，如6 0孔，A液12000 u l,B液2 4 0 u l）3將樣品稀釋到一定倍數才能定量,（10倍,20倍,30倍），每孔需要20u 1樣品（2u 1樣品+1 8ulPBS即稀釋10倍）, 做三個重復則需要 60 u I, 般配80ul4配蛋白標準樣品,將2 mg / m I得蛋白標準溶液稀釋至0。5m g/

5、 ml,若配200ul得0、5mg / ml蛋白標準溶液則需要50ul得2 m g/ml得蛋白標準溶液與150u 1PBS溶液5將稀釋好得樣品加入孔板中（標記得區(qū)域）,接著標準品按0 ,1,2,4,8,12,1 6,20ul加到標號得區(qū)域，之后在加標 準樣品得孔內，將孔內溶液用PBS補足到20 u l6每孔加200 u l配好得工作液，平行加，不能上下加，以減少誤差7將加好得96孔板放在3 7 C下孵育3 0分鐘8孵育完后，放在酶標儀輕微震蕩310s,中速,吸光值59 5 n m，進行比色測定，記錄標準曲線及樣品吸光值數據后，以蛋白含量（ml）為橫坐標，吸光值為縱坐標作標準曲線。（R2 0.9

6、8才有用，酶標儀操作：兩個箭頭圖標,1就 是結果,2就是保存）9計算蛋白含量（注意定量樣品已經稀釋了10倍）蛋白質定量標準曲線加樣量骨口. 序號12345678標準蛋白量/ul （0。5mg/ml)背景液(P B S)/u 120標準液濃度m g/ml00 .0 2 5 0、050。10、20。30。40。5三、SDS- PAGE電泳1。配膠（12 %，可以提前配好）準備:玻璃板，梳子,AP（解凍,現拿現用），聚丙烯酰胺（4 C冰箱冷藏）（1）玻璃板驗漏5min（2）按表配置分離膠 （3）灌膠，加酒精封壓，凝3 0min（注意不要有氣泡）（4 ）按表配濃縮膠，倒掉酒精，用吸水紙吸去酒精，灌膠，

7、插梳子（注意不要有氣泡），凝3 0m i n（5 ）取膠，用水沖洗一下濃縮膠，加少量水放入一次性手套中4 C冰箱保存?zhèn)溆?。樣品處理準備:PB S移液槍，1。5 ml E P管（1）稀釋樣品：一般每孔上樣5ul，即1mg/ml濃度得樣品，測完蛋白含量后，將樣品用PBS稀釋至1mg /m 1 （注 意1 oad i ngb u ffer得加入也得算入）取出上樣樣品1 5 ul至1、5 m l離心管中 加入6 X SDS上樣緩沖液3ul至終濃度為1XO （上樣總體積 一般不超過15卩l(xiāng),加樣孔得最大限度可加20卩l(xiāng)樣品。）將樣品在10 0C煮5 mi n震蕩使蛋白完全變性（注意儀器操作）3O 電泳

8、準備：電泳液5 0 0m1 （現配）,蛋白膠，1 0 ul移液槍（槍頭）樣品,Ma rke r，冰盒，電泳裝置（1）將SD S PAGE膠放入電泳槽中，加足夠得電泳液。（短玻璃板面向內，長玻璃板面向外、若只跑一塊膠 ,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字得一面面向外。電泳液至少要漫過內測得短玻璃板、注意先檢漏。）（2）上樣、 用移液槍貼壁吸取樣品 ，將樣品吸出不要吸進氣泡、將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔 ，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時 ，進樣器需在外槽電泳緩沖液中 洗滌 3 次 ，以免交叉污染、 ）（3）先設置80V開始電泳，樣品溴酚藍跑至分離膠后增

9、至120V電壓，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜、 （此時準備好電轉液 ）四、轉膜準備：電轉液（現配4C冰箱冷藏），鑷子，濾紙,PV DF膜（0o 45u m ）,電轉裝置，冰盒1. 在加有轉移液得盤里放入轉膜用得夾子、兩塊海綿墊2. 濾紙浸入電轉液中，P VDF膜在甲醇中潤濕成半透明，小心將膜放入4C電轉液中平衡至少5min。3 . 將夾子打開使黑得一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面得氣泡、 （一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。 ）在墊子上墊三層濾紙 （可三張紙先疊在一起在墊于墊子上 ），一手固 定濾紙一手用玻棒搟去其中得氣泡。4. 先將玻璃板撬掉才可

10、剝膠 ，撬得時候動作要輕 ，要在兩個邊上輕輕得反復撬、撬一會兒玻璃板便開始松動 直到撬去玻板。 （撬時一定要小心 ，玻板很易裂。 ）除去小玻璃板后 ，將濃縮膠輕輕刮去 （濃縮膠影響操作 ），要避 免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上 （做好標記 ），用手調整使其與濾紙對齊 ，輕輕用玻棒搟去氣泡、 將膜蓋于膠上 ，要蓋滿整個膠 （膜蓋下后不可再移動 ）并除氣泡。 在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。 最后蓋上另一 個海綿墊 ，搟幾下就可合起夾子。 整個操作在轉移液中進行 ，要不斷得搟去氣泡。 膜兩邊得濾紙不能相互接觸 接觸后會發(fā)生短路、 （轉移液含甲醇 ，操作時要戴手套 ，實驗室要開門以使空氣流

11、通。 ）5. 將夾子放入轉移槽中 （電轉移時會產熱 ，漿槽放入冰中 ），要使夾得黑面對槽得黑面 ，夾得白面對槽得紅面。 一 般用 100mA 轉移 90min 。6. 轉完后將膜用IX麗春紅染液染5m 1 n（于脫色搖床上搖 卜然后用水沖洗掉沒染上得染液就可瞧到膜 上得蛋白、將膜晾干備用。 （準備封閉液 ）六、免疫反應準備:封閉液，一抗，二抗,T BST1 。 將膜移至含有封閉液得平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉2ho2. TB ST洗4次。每次5分鐘。3. 將膜按照目得蛋白所處位置剪切并做好標記，加入相對應得一抗，室溫孵育2h或者4 C過夜4. 室溫下孵育12 h后，用 TBST在室溫下脫色搖床上洗四次 ，每次5min5o同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗 4次，每次5 min七、顯影準備:樣品膠片，移液槍（2 00 u I）,中槍頭,吸水紙，顯影液（A+ B）,薄鑷子一抗二抗目得蛋白7 8 kdBip 1 : 1 00 0兔二抗75kd目得蛋白34kd G5APDH內參1