植物源酯酶農(nóng)藥殘留快速檢測試紙的研制與應(yīng)用進展5400字

1、植物源酯酶農(nóng)藥殘留快速檢測試紙的研制與應(yīng)用進展5400字 隨著社會的發(fā)展，溫飽問題逐漸被食品安全和綠色食品所取代，然而，生產(chǎn)者為了提高產(chǎn)量和減少病蟲害危害，化學(xué)防治仍然是當(dāng)前最主要的防治方法，近30a大多數(shù)國家農(nóng)藥施用量增加了35%40%1。過度使用農(nóng)藥會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，通過生物鏈最終被人體吸收，這對人體的內(nèi)分泌和生殖發(fā)育照成慢性毒性2。特別是有機氯農(nóng)藥，如艾氏劑、雙對氯苯基三氯乙烷（DDT）和六氯環(huán)己烷（HCH），具有較強的持久性、蓄積性、毒性和環(huán)境遷移能力，從而導(dǎo)致了更大的危險系數(shù)3。因此，如何快速檢測農(nóng)藥殘留成為當(dāng)前重要命題。目前，農(nóng)藥殘留分析方法主要有：薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（

2、GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）、超臨界流體色譜（SFC）、 毛細(xì)管電泳（CE）、免疫分析（IA）。但是，上述方法需要實驗專員操作，且費時費力，一般應(yīng)用于實驗室進行定量分析4；為了滿足現(xiàn)場檢測的需求，農(nóng)藥殘留快速檢測試紙的研制與開發(fā)得到重視，基于植物酯酶比動物酯酶更便宜和易保存等特點，因此開發(fā)出反應(yīng)靈敏的植物源酯酶是當(dāng)前研究熱點。本文綜述植物酯酶酶抑制發(fā)檢測農(nóng)藥殘留的工作原理、酶源、檢測方法、主要應(yīng)用領(lǐng)域等，以期進一步認(rèn)識植物酯酶在農(nóng)藥快速檢測中的研究現(xiàn)狀。1 植物酯酶檢測農(nóng)藥殘留的原理植物酯酶抑制法，通過樣品中含有的農(nóng)藥與酯酶反應(yīng)

3、后，顯色劑同底物反應(yīng)的比色原理測定農(nóng)產(chǎn)品當(dāng)中的農(nóng)藥殘留量。具有短測量時間、高靈敏度、結(jié)果可靠和檢測體系容易實現(xiàn)等特點。基于其比色原理，目前的測定方法有靛酚乙酯法和固藍 B鹽法等。1.1 固藍B鹽法檢測植物酯酶的原理當(dāng)植物酯酶遇到有機磷農(nóng)藥時，農(nóng)藥能抑制植物酯酶活性，而活性能用比色來測定，即如果樣品中農(nóng)藥殘留量很低，植物酯酶活性沒有受到抑制，則反應(yīng)得到的紫紅色偶氮化合物的則多，顯色明顯；反之，如果農(nóng)藥殘留量很高，植物酯酶的活性受到抑制，反應(yīng)得到的紫紅色偶氮化合物的較少，則不能顯色或很少。其中顯色反應(yīng)方程式如下5：乙酸-α-萘酯+水 萘酚+乙酸固藍B鹽+萘酚 紫紅色偶氮化合物+氯化鋅+

4、鹽酸1.2 2，6-二氯靛酚法檢測植物酯酶的原理當(dāng)樣品中含有機磷類農(nóng)藥時，會抑制植物酯酶的活性，底物分解過程變慢或者不分解，溶液不變色或為淺藍色，吸光值則較高；反之，如果農(nóng)藥殘留量很低，植物酯酶的活性不受其影響，底物分解很快，最終顏色很藍，吸光值則較低。因此吸光與農(nóng)藥殘留量呈正相關(guān)。其中顯色反應(yīng)方程式如下6：碘化硫代膽堿 硫代膽堿硫代膽堿 +2，6-二氯靛酚 藍色褪卻2 植物源酯酶的篩選目前，植物源酯酶研究發(fā)展迅速，國內(nèi)外陸續(xù)在不同作物不同部位中提取酯酶，大部分已經(jīng)進行農(nóng)藥殘留分析試驗（表1）。以往研究數(shù)據(jù)表明不同作物的植物酯酶活性和靈敏度不同，且同一種作物但不同部位活性和靈敏度也不相同。且來

5、源不同的植物酯酶對其活性的影響較明顯，如植物酶源的品種、批次都會直接對檢測結(jié)果的重現(xiàn)性產(chǎn)生一定影響7。但目前對植物酯酶的特征上和產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機制尚不完全清楚8，導(dǎo)致植物酯酶在農(nóng)藥殘留檢測應(yīng)用中受到阻礙。因此，研究植物酯酶的特性以及篩選植物源酯酶顯得尤為重要。3 應(yīng)用條件試紙法（速測卡法）是根據(jù)酶抑制法的原理檢測農(nóng)藥殘留，將浸漬了膽堿酯酶或其它敏感酶類的濾紙片作為檢測酶片，根據(jù)試紙的顏色變化來反映酶活性受到農(nóng)藥抑制的程度。該方法可用肉眼直觀的辨認(rèn)來判定農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)。該法操作簡單、使用方便，但靈敏度較低，一般在初步篩查鑒定使用，且由試紙法檢測結(jié)果的符合率超過80%17。在使用過程中需要注意幾

6、個問題：速測卡需保存于干燥的地方，冷藏保存1a，開封后7d內(nèi)使用最佳；速測試紙可以檢測有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，但是對其它類型的農(nóng)藥無法檢出；隨機抽取34個樣品，且每個樣品葉片、果實、葉柄和莖也需檢測；制樣時注意更換或洗凈制樣工具，如剪刀、燒杯等，防止樣品間交叉污染；浸樣時間不宜過長或過短，一般510 min，避免假陽性的發(fā)生?？傊跈z測過程中需要細(xì)致的把握每一個環(huán)節(jié)。4 應(yīng)用前景植物酯酶的提取工藝是保障酯酶活性和檢測靈敏度的關(guān)鍵；同時，純化酯酶可以提高酶的活性；酶的固定化工藝使酶固化，有利于儲存和使用，適合快速分析篩查?，F(xiàn)在，已經(jīng)有很多研究對植物酯酶的提取條件進行優(yōu)化，劉文君等6通過比

7、較底物優(yōu)越性研究，結(jié)果表明2，6-二氯靛酚乙酸酯與植物酯酶反應(yīng)效果更好。陳士恩等18通過真空冷凍濃縮，羧甲基纖維素層析，及真空冷凍干燥，提取小麥酯酶量達2.3%；吳定等19用70%飽和硫酸銨對小麥酯酶進行純化，酶催化反應(yīng)溫度在 45、pH4.55.5時酶活性最大。張寧20和黃志勇21通過正交設(shè)計優(yōu)化酶抑制法的測定條件，獲得的植物酯酶在pH6.0時最優(yōu)，與動物酯酶測量精確度沒有顯著差異，符合農(nóng)藥殘留分析要求。侯明迪22使用小麥酯酶測定有機磷農(nóng)藥DDVP和甲基對硫磷的條件、方法，通過加入活化劑使甲基對硫磷對酶活性的抑制提高了50100倍，建立了甲基對硫磷和DDVP的酯酶抑制方程，方法的最小檢出濃度

8、分別是0.01x10-6mg“kg-1、0.166x10-6 mg“kg-1。由此可見，實際應(yīng)用中植物酯酶的活性受到許多因素的影響。充分地開展不同因素對酯酶活性的影響對植物酯酶抑制法的實際應(yīng)用具有很大的指導(dǎo)意義。但是到目前為止真正能投入工業(yè)生產(chǎn)的植物酯酶很少，故還需進一步的研究和發(fā)展。5 問題與展望傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測方法通常是復(fù)雜的，耗時的，破壞性的?？焖佟o損、實時在線是農(nóng)殘檢測的發(fā)展方向。且試紙成本需1.01.5元/個樣品23。目前，酶抑制法檢測的農(nóng)藥種類只有有機磷和氨基甲酸酯類2種，方法精度較低，且檢測限大多高于國際、國內(nèi)規(guī)定的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。陽性檢測結(jié)果還需進一步利用儀器進行定性、定

9、量，因此不能作為法律仲裁依據(jù)24。目前，各速測產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)或通過自主分離、提取和純化，或通過市場直接購買，或直接委托其他企業(yè)或單位幫助生產(chǎn)酶試劑，這些酶因為不同的來源、類別、生產(chǎn)工藝等原因，在活性和穩(wěn)定性等質(zhì)量上都有較大的差別25，26。綜上所述，農(nóng)藥殘留快速檢測在得到了快速發(fā)展和應(yīng)用的同時，還存在著許多未解決的問題。因此，需要建立一套有效的農(nóng)藥殘留速測產(chǎn)品的認(rèn)定管理辦法，加強對速測產(chǎn)品的監(jiān)督管理，進而對速測產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售市場進行規(guī)范，從而推進速測方法、產(chǎn)品在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的廣泛使用27；應(yīng)加大對農(nóng)殘速測技術(shù)的研究，加強科研立項和經(jīng)費投入，組織研發(fā)、生產(chǎn)、管理、使用等農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)機構(gòu)之間的合

10、力攻關(guān)，從而快速解決目前農(nóng)藥殘留速測方法中存在的農(nóng)藥檢測范圍小、靈敏度低、準(zhǔn)確性差等關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題，以提升我國農(nóng)藥殘留的速測技術(shù)水平28。參考文獻1 Liu YB， Pan XB， Li JS. A 1961–2010 record of fertilizer use， pesticide application and cereal yields： a review J. Agronomy for Sustainable Development， 2015， 35（1）： 83-93.2 Sugeng AJ， Beamer PI， Lutz EA， et al. Hazard-

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