最新相關(guān)土壤酶測(cè)定方法(綜合)

1、最新相關(guān)土壤酶測(cè)定方法合）（綜土壤蛋白酶活性測(cè)定 （茚三酮比色法 ）實(shí)驗(yàn)試劑：1、pH7.6 的 0.05mol/L 的 tris HCL緩沖液 （三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖 液 ）: 50ml0.2mol/L 的三羥甲基氨基甲烷與 27.5ml0.2mol/L 的鹽酸混合 , 稀釋成 200ml。2、2%酪酸鈉溶液 : 稱(chēng)取2g 酪酸鈉, 加入10ml0.1mol/L 的NaOH溶液,沸水浴處理 5min, 待膨化后加入 pH7.6的tris HCl緩沖液約80ml, 繼續(xù)沸水浴處理 , 直至完 全溶解, 用同樣的緩沖液定容至 100ml。3、Tris HClCaCl2混合溶液 :用pH7.6

2、的0.05mol/Ltris HCl緩沖液配制的 0.01mol/L 的 CaCl2溶液。4、0.6mol/L 乙酸鉛溶液。5、草酸鈉乙酸混合溶液 : 每1000ml0.26mol/L 的草酸鈉溶液含有 240.7ml0.2mol/L 的乙酸。6、茚三酮乙醇抗壞血酸混合試劑 : 稱(chēng)取2g茚三酮,0.02g 抗壞血酸 , 溶于 100ml無(wú)水乙醇。7、0.2%KIO3溶液。8、pH5.8乙酸乙酸鈉緩沖液 :94 ml0.2mol/L 乙酸鈉與 6ml0.2mol/L 乙酸混合。9、0.01%甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 :1g甘氨酸溶于 1000ml水,再稀釋10倍。10、甲苯。 以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)儀器

3、:基本儀器如試管、燒杯等、離心機(jī)、分光光度計(jì)、刻度試管、水浴鍋、電子天 平、移液管實(shí)驗(yàn)步驟1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別吸取50 、100、150、200、250、300l0.01%甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 , 置于 10 ml刻度試管中 （濃度分別相當(dāng)于 NH2 0.107 、0.213 、0.320 、 0.426 、 0.533 、0.639 g/ml）, 加入2mlpH5.8的乙酸乙酸鈉緩沖溶液 加入1.5ml 茚三酮乙醇抗壞血酸混合試劑 , 混合均勻 , 沸水浴加熱 16min 取出立即用自來(lái)水冷卻 15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均勻 , 用蒸餾水定 容至10ml,1h內(nèi)在570nm

4、處比色測(cè)定吸光值 ;以氨基氮 （NH2）的濃度為橫坐 標(biāo), 吸光值為縱坐標(biāo) , 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2、培養(yǎng)與測(cè)定 稱(chēng)取0.200g土壤,加入2mlTris HClCaCl2混合溶液和 1ml甲苯,混 合均勻后靜置 15min以抑制微生物活性； 然后再加入 5ml2%的酪酸鈉溶液 ,50 振蕩培養(yǎng) 2h。對(duì)照土壤在培養(yǎng) 過(guò)程中不加酪酸鈉溶液 , 但在培養(yǎng)結(jié)束后加入 , 且加入的酪酸鈉也經(jīng) 歷50、 2h的振蕩培養(yǎng)過(guò)程。 培養(yǎng)結(jié)束并在對(duì)照中加入酪酸鈉后 , 充分混合 , 置于 04冷藏柜中靜置 30min。取出加入 1.5ml0.6mol/L 乙酸鉛溶液 ,6000r/min 離心10min, 取上清

5、 液1.5ml, 加入457 l 草酸鈉乙酸混合溶液 , 17000r/min 再離心 10min； 小心吸取 1ml上清液，置于 10ml刻度試管中 , 加入 2mlpH5.8的乙酸乙酸 鈉緩沖溶液 ,再加入1.5ml 茚三酮乙醇抗壞血酸混合試劑 ,混合均勻, 沸水浴加熱 16min, 取出立即用自來(lái)水冷卻 15min, 加入 1ml0.2%KIO3并混 合均勻, 用蒸餾水定容至 10ml,1h內(nèi)在570nm處比色測(cè)定吸光值。注:每個(gè)土樣設(shè)置 5個(gè)重復(fù)。結(jié)果計(jì)算NH2(g)=a150式中,a為比色液吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的濃度 , 單位為(NH2g/ml),150 為換 算為每個(gè)樣品 NH2

6、總含量的系數(shù)。蛋白酶的活性以 50培養(yǎng) 2h,5g 土壤中 NH2的g 數(shù)表示(為便于比較 ,也可以 換算為 1g烘干土, 表示為 NH2g/g 烘干土)。芳基硫酸酯酶的活性測(cè)定(比色法)1. 方法原理：芳基硫酸酯酶酶促有機(jī)硫化物脫 硫成為無(wú)機(jī)形態(tài)。 基于堿性條件下， 芳基硫酸酯 酶作用 n-硝基酚硫酸酯，比色測(cè)定水解生成的酚 量表示酶的活性。2. 藥品及試劑配置： 對(duì)硝基酚硫酸鉀，醋酸， CaCl2 2H2O,NaO，H 對(duì)硝基酚，甲苯 0.005 mol/L 對(duì)硝基酚硫酸酯溶液：0.1287g 4-硝基苯硫酸鉀（ 對(duì)硝基苯基硫酸鉀 ） 溶于醋酸緩沖液（ Ph=5.8），并用同一緩沖液將 溶

7、液定容至 100 mL 溶液保存在冰箱中。 0.5 mol/L 醋酸緩沖液（ Ph=5.8） 0.5 mol/L CaCl2 2H2O 0.5 mol/L NaOH n- 硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液： 取 1 g 對(duì)硝基酚溶于水 并定容至 1 L （1 mL 含 1 mg）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：取 1 mL 對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 稀釋至 100 mL （1 mL 含 10 g），然后取不同 量的稀釋液配成系列， 用以測(cè)定芳基硫酸酯酶活 性相同的方法， 使對(duì)硝基酚顯色， 比色后制成標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)。3. 操作步驟：加幾滴甲 苯1 g 土壤置于 50 mL 三角瓶 再 加 4 mL 醋酸緩沖液（ Ph=5.8）1 mL 0.

8、005 mol/L 對(duì)硝基酚硫酸酯 搖蕩，蓋緊，于 37 恒溫箱培養(yǎng) 1 h 。培養(yǎng)結(jié)束，加 1 mL 0.5 mol/L CaCl2 和 4 mL0.5 mol/L NaOH，用慢速濾紙過(guò)濾，培養(yǎng)混合 物，取濾液在分光光度計(jì)上于 400 nm 處比色， 測(cè)定濾液的黃色深度。試驗(yàn)需設(shè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照。其它測(cè)定方法土壤芳基硫酸酯酶活性，以 1 g 土壤在 1 h 內(nèi)釋出的對(duì)硝基酚的微克數(shù)表示。 一種檢測(cè)土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法， 其特征在于： ）分別稱(chēng)取鮮土樣 品份分別置于個(gè)三角瓶中， ， 分 成二組，每組個(gè)， 向個(gè)三角瓶中加入 乙酸緩沖溶 液，向第一組個(gè)三角瓶中加入 -1 （ 0.025 0

9、.050mol ） . 的底物對(duì)硝基苯硫酸鉀工作液， 第二組個(gè)三角 瓶作底物試劑對(duì)照，混勻，蓋好瓶塞，放在 恒溫培養(yǎng)中恒溫培養(yǎng)； ）培養(yǎng)結(jié)束后， 加入 . -1 堿性 （三羥基 氨基甲烷）溶液和 . -1 氯化鈣溶液，并向第二組三角瓶中-1 加入 . 的 底物對(duì)硝基苯硫酸鉀工作液， 混勻，過(guò)濾； ） 用分光光度法于 410處分別測(cè)定上述所得三角瓶中溶液的吸光度； 以對(duì)硝基苯酚溶液標(biāo) 準(zhǔn)溶液，以對(duì)硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別 用分光光度法在測(cè)定的吸光值制 作工作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 得到斜率； 根據(jù)吸光值 和斜率，計(jì)算所測(cè)定濾液中對(duì)硝基苯酚的濃度，； 計(jì)算樣品中對(duì)硝基苯酚含量 ； ）計(jì)算磷酸單酯酶酶活性

10、： 計(jì)算公式為：（）干土 . 式中：?jiǎn)挝?土壤單位時(shí)間內(nèi)對(duì)硝基苯酚的產(chǎn)生量；：測(cè)試溶液中對(duì)硝基苯酚的質(zhì)量，樣品 測(cè)定吸光值折換的產(chǎn)物質(zhì)量值； ：鮮 土樣品質(zhì)量；：水分系數(shù)，單位重量的烘干土 重鮮土重過(guò)氧化物酶活性分原理過(guò)氧化物酶能氧化土壤中的有機(jī)物質(zhì)， 過(guò)氧化物 酶酶促鄰苯三酚氧化為醌， 用乙醚提取生成紫色 沒(méi)食子素，比色著色的乙醚相，該乙醚相在 430nm 處有最大光吸收值， 采用的是鄰苯三酚比 色法。步驟（ 1）標(biāo)曲的制作：重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱(chēng)取 0.75g 重 鉻酸鉀溶于 1L0.5mol/LHcl （相當(dāng)于 50mL 乙醚 中含 5mg 紫色沒(méi)食子素）。表 4 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配

11、置編號(hào)012345678標(biāo)液/mL00.51.52.53.54.55.56.57.50.5mol/LH109.58.57.56.55.54.53.52.5cl/mL光吸收0.00.10.20.30.40.50.50.6值4322817058388混合均勻后在430nm 處比色。以吸光值為橫坐標(biāo)、 沒(méi)食子素的含量為縱坐標(biāo) 計(jì)算直線(xiàn)回歸方程 y=a+bx 及相關(guān)系數(shù) R，即沒(méi) 食子素含量 C（mol）=a+bA430，通過(guò)計(jì)算得到 回歸方程為：C （ mol ） =-0.0005+0.10912A430,R=0.9998,R =0.9997（2）過(guò)氧化物酶活性測(cè)定：稱(chēng)取 0.16g 砂土于 10m

12、l 離心管中，加入 2mL1% 鄰苯三酚溶液和 0.4mL0.5%H 2O2溶液， 充分振蕩混合均勻， 30恒溫箱培養(yǎng) 2 小時(shí)； 加入 0.8mLpH4.5 檸檬酸 -磷酸鹽緩沖液，加入 7mL 乙醚，充分振蕩，萃取 30min;吸取乙醚相液體在 430nm 處比色 計(jì)算方法 土壤過(guò)氧化物酶活性用每克土中沒(méi)食子素的毫 克數(shù)表示，即（ g / h g W ）=CV稀釋倍數(shù) / （Wt）式中： C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得樣品中沒(méi)食子素濃 度（ g /mL）；V 樣品反應(yīng)的總體積（ mL ）；t 反應(yīng)時(shí)間（ h）；W 樣品土壤的重量（ g）；脲酶（比色法 ）1. 試劑的配制：1）PH=6.7 檸檬酸鹽緩沖液

13、的配制：368g 檸檬酸，加入 600mL 蒸餾水及 295gKOH 溶解 ，混勻并定容至 2L ，用 1mol/LNaOH 調(diào) PH=3.62）苯酚鈉溶液：稱(chēng)取 62.5g 苯酚，溶于少量乙醇，加入 2mL 甲醇及 18.5mL 丙酮， 加乙醇稀釋至 100mL（A 液），存入冰箱稱(chēng)取 27gNaOH 溶于 100mL 水中（B 液）存入 冰箱3）次氯酸鈉溶液用水稀釋制劑， 至活性氯濃度為 0.9% 至溶液 穩(wěn)定4）10%尿素液5）甲苯6） N 的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱(chēng)取 0.4717g 硫酸銨，定容至 1L，則得 1mL 含 0.1mg 氮的標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)， 可再將此液稀釋 10 倍供用

14、。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：吸取稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液 1， 3， 5， 7，9，11，13 mL 移于 50 mL 容量瓶中，然后加 蒸餾水至 20 mL。再加 4 mL 苯酚鈉溶液和 3 mL 次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。 20min 后顯色，定 容， 1h 內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng) 578nm 處根據(jù) 光密度值與溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。操作步驟：5 g 風(fēng)干土置于 50 mL 三角瓶中，加 1 mL 甲苯 15 min 后 加 10 mL 10尿素液和 20 mL pH=6.7 檸檬酸鹽緩沖液 搖勻，在 37 恒溫箱中培養(yǎng) 24 h 過(guò)濾后取 3 mL 濾液注入 50 mL 容量瓶中，然后按 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯色方法進(jìn)

15、行比色測(cè)定。計(jì)算：脲酶活性以 24 h后 1 g 土壤中 NH3N 的毫克 數(shù)表示 .NH3-N （mg）= a*2式中， a從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得 NH3-N 毫克數(shù)2 換算成 1 g 土的系數(shù)法二 土壤脲酶測(cè)定（改進(jìn)的） 待測(cè)土樣風(fēng)干，過(guò) 80 目篩。精確稱(chēng)取 0.200g 土樣于 10ml 圓底塑料離心管中，加入 0.2ml 甲 苯，振蕩搖勻。 15 分鐘后，加入 2ml 10%尿素 溶液和 4ml pH=6.7 的檸檬酸鹽緩沖液，加蓋搖 勻，于 37培養(yǎng) 24 小時(shí)。取出后搖勻， 于 3800r 離心 5 分鐘，吸取上清液 0.6ml 于 10ml 試管， 加入 3.4ml 蒸餾水，再加入 0

16、.8ml 苯酚鈉溶液和 0.6ml 次氯酸鈉溶液， 隨加隨搖勻。 待 30 分鐘后 顯色，加入 4.6ml 蒸餾水，定容至 10ml。于 1 小時(shí)內(nèi)，在 578nm 下比色，記錄光吸收值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精確稱(chēng)取 0.0472g 硫酸銨，加 蒸餾水溶解， 定容至 1L，則 1ml 含 0.01mg氮的 標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別吸取氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.6、1.0、 1.4、1.8、2.2、2.6ml 于 10ml 離心管中，對(duì)照組 不吸取氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入蒸餾水至4ml，再加入 0.8ml 苯酚鈉溶液和 0.6ml 次氯酸鈉溶 液，隨加隨搖勻。 待 30 分鐘后顯色， 加入 4.6ml 蒸餾水

17、，定容至 10ml。于 1 小時(shí)內(nèi)，在 578nm 下比色， 記錄光吸收值。 以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐 標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。酸性磷酸酶活性測(cè)定（一）原理 該方法以對(duì)硝基苯磷酸二鈉（即 pNPP）為基質(zhì)，基質(zhì)在土壤酸性磷酸酶的 催化下水解生成黃色色的對(duì)硝基苯酚（即 pNP），該黃色溶液在 410nm 處有最 大吸收光值，根據(jù)對(duì)硝基苯酚的生成數(shù)量與黃色溶液的吸光度呈正比來(lái)進(jìn)行定 量分析，以此來(lái)反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是對(duì)硝基苯磷酸二鈉比色 法。（二）測(cè)定方法稱(chēng)取壤土 0.3g、砂土 0.5g、粘土 0.1g風(fēng)干土于 50 mL 離心管中，加入 0.2 mL 甲苯和 4 mL M

18、UB （MUB 即通用緩沖液， pH =6.5），再加 1 mL 0.05 mol/L對(duì) 硝基苯磷酸鈉溶液 （用 MUB 配），搖勻后加蓋，放進(jìn) 3637的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng) 1 個(gè)小時(shí)；培養(yǎng)完成后取出加入 0.5 mol/L的 CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL， 搖勻；而后轉(zhuǎn)入 10mL 塑料離心管中在 2500r/min 下離心 5min； 取上清液在 410 nm 處比色，并記錄吸收光值。（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 取 9 支玻璃試管，按順序編號(hào)，并按表 2 加入試劑。表 2 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制表離心管號(hào)0123456780.05?mol/mLpNP（mL ）0

19、0.050.10.20.30.40.50.60.7H2O （mL ）0.80.750.70.60.50.40.30.20.1pNP 的含量（ ?mol） 0 ；0.0025；0.005；0.01；0.015；0.02；0.025；0.03；0.035 搖勻0.2mol/LpH6.5 磷酸緩沖液（ mL）0.5mol/L CaCl2（mL ）0.5mol/L NaOH（ mL）4混勻后，轉(zhuǎn)入 10mL 的離心管中，在 2500r/min 下離心 5min，以 0 號(hào)作為對(duì) 照，在 A410nm 波長(zhǎng)下測(cè)光吸收值，并記錄光吸收值 A410。以吸光值為橫坐標(biāo)、 對(duì)硝基苯酚的含量為縱坐標(biāo)計(jì)算直線(xiàn)回歸方

20、程 y=a+bx 及 相關(guān)系數(shù) R，即對(duì)硝基苯酚含量 n（?mol）=a+b A410，通過(guò)計(jì)算得到回歸方 程為：n（mol）=-0.0000+0.0594 A410,R=0.9992,R2=0.99（四）計(jì)算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用單位時(shí)間內(nèi)每克土中的對(duì)硝基苯酚的微克數(shù)表示， 即（?g/ h g W） =n M 稀釋倍數(shù) /（Wt）式中： n標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得樣品中對(duì)硝基苯酚的濃度（ ?mol）；M 對(duì)硝基苯酚的相對(duì)分子質(zhì)量（為 139.11 單位是 g/mol）； t 反應(yīng)時(shí)間（ h ）；W 樣品土壤的重量（ g）土壤酸性磷酸酶測(cè)定 （改進(jìn)后 ） 待測(cè)土樣風(fēng)干，過(guò) 80 目篩。精確稱(chēng)取 0

21、.200g土 樣于 10ml 圓底塑料離心管中， 加入 0.2ml 甲苯， 振蕩搖勻。 15 分鐘后，加入 4ml pH=6.5 磷酸緩 沖液，再加入 1ml 0.05M 對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液 （以 pH=6.5 磷酸緩沖液配制），加蓋搖勻，于37培養(yǎng) 1 小時(shí)。取出后搖勻，加入 1ml 0.5M 氯化鈣溶液和 4ml 0.5M 氫氧化鈉溶液，振蕩搖 勻，于 2500r 離心 5 分鐘。吸取上清液 5ml，于 3800r 離心 5 分鐘，于 1 小時(shí)內(nèi)，在 410nm 下比 色，記錄光吸收值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精確稱(chēng)取 0.0696g對(duì)硝基苯酚， 定容至 100ml，取 10ml 再次定容至 1

22、00ml。則 得到 0.5umol/ml 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9ml 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)照組不吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液， 并定容至 1ml，搖勻后加入 4ml pH=6.5 磷酸緩 沖液、1ml 0.5M 氯化鈣溶液和 4ml 0.5M 氫氧化 鈉溶液，振蕩搖勻，于 2500r 離心 5 分鐘，再于 3800r 離心 5 分鐘。于 1 小時(shí)內(nèi)，在 410nm 下比 色，記錄光吸收值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)， 以光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。脫氫酶活性測(cè)定（一）原理該方法以 2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（ TTC

23、 ）為基質(zhì)，基質(zhì)接受脫氫酶 活化的酚，生成紅色的 2，3，5-三苯基甲月替（ TTF ），該紅色溶液在 485nm 處 有最大的吸收光值，根據(jù)甲月替的生成數(shù)量與紅色溶液的吸光度成正比來(lái)進(jìn)行 定量分析，采用的是 TTC 還原比色法。（二）步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作(1) 取一支大試管，用移液管移取 0.2ml3%TTC 溶液，再加入少量保險(xiǎn)粉， 搖勻，最后移取 9.8ml 甲醇溶液。試管內(nèi)的混合液記為母液。(2) 取 6 支試管，按順序編號(hào)，并按表 4加入試劑。表 4 TTC 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制表試管號(hào)0123456600mg/ml TTF(ml)00.250.35 0.50.751.01.25TTF 濃

24、度 (mg/ml)0152130456075甲醇 (ml)109.759.65 9.59.259.08.75(3) 混勻后，比色，以 0 號(hào)作為對(duì)照，在 485nm波長(zhǎng)下測(cè)光吸收值，并記錄 光吸收值 A485。(4) 以吸光值為橫坐標(biāo)， TTF 的濃度為縱坐標(biāo)計(jì)算直線(xiàn)回歸方程 y=a+bx 及 相關(guān)系數(shù) R，即 TTF 濃度 C(mg/L)=a+b*A485, 通過(guò)計(jì)算得到回歸方程為： C(mg/ml)=3.0605+75.4514*A485,R=0.9999,R2=0.9999 2.脫氫酶活性的測(cè)定(1)稱(chēng)取風(fēng)干土樣壤土 0.5g、黏土 0.5g、沙土 1.0g于 50ml 的塑料離心管中，

25、 加入 0.5ml 0.5% 的葡萄糖溶液，混勻，再加入 0.2ml 3%TTC 溶液，混勻后在 36-37 攝氏度的培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng) 24h。(2)培養(yǎng)完成后，加 2滴濃硫酸終止反應(yīng)，再加入 10ml 甲醇，徹底混勻(蓋上 蓋子，上下?lián)u動(dòng))。(3)而后轉(zhuǎn)入 10ml 塑料離心管中在 2500r/min 下離心 5min。(4)取上清液在 485nm 下比色，記錄吸收光值 A485。(三) 計(jì)算方法 土壤脫氫酶的活性用每克土中的 TTF 的微克數(shù)表示，即 (mg/h g W)=C*V* 稀 釋倍數(shù) /(W*t)式中： C標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得樣品中 TTF 濃度(mg/ml);V 樣品反應(yīng)的總體積 (

26、ml);t反應(yīng)時(shí)間 (h);W 樣品土壤的重量 (g)。 土壤脫氫酶測(cè)定 (實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的 ) 待測(cè)土樣風(fēng)干，過(guò) 80 目篩。精確稱(chēng)取 0.200g土 樣于 10ml 圓底塑料離心管中，加入 0.25ml 0.5% 葡萄糖溶液，振蕩搖勻，再加入 0.1ml 3% 紅四 氮唑溶液，加蓋搖勻，于 37培養(yǎng) 24 小時(shí)。取 出后搖勻，滴加 2 滴濃硫酸，再加入 5ml 甲醇， 振蕩搖勻，于 2500r 離心 5 分鐘。于 1 小時(shí)內(nèi)， 在 485nm 下比色，記錄光吸收值。土壤蔗糖酶活性測(cè)定1.原理采用 3,5-二硝基水楊酸比色法。 該方法以蔗 糖為基質(zhì)，基質(zhì)在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄 糖，葡萄糖和 3

27、,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成橙黃色 的 3-氨基-5-硝基水楊酸，并在 508nm 波長(zhǎng)下有 最大吸光值。2.測(cè)定方法稱(chēng)取壤土 0.15g、砂土 0.3g、粘土 0.1g 風(fēng) 干土于 10mL 離心管中，加入 0.06 mL 甲苯和 1mL ph5.5 磷酸緩沖液，再加 3mL 8% 蔗糖溶 液，搖勻后加蓋，放進(jìn) 3637的培養(yǎng)箱中進(jìn)行 培養(yǎng) 24 個(gè)小時(shí)；培養(yǎng)完成后取出，搖勻，并于 4000r/min 離心 5min；取上層清液 0.2ml 于 20ml 玻璃管中，并 加入 0.5ml3,5-二硝基水楊酸，再立即將玻璃管沸 水浴中加熱 5min，加熱完畢后在自來(lái)水流下冷卻 3min ；將顯色液

28、體用蒸餾水稀釋到5ml ，在508nm 波長(zhǎng)下比色，記錄吸光值。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作取 500mg 真空干燥的葡萄糖溶于 100ml 飽 和苯甲酸溶液中 ( 5mg葡萄糖 /ml)，即為標(biāo)準(zhǔn)葡 萄糖溶液。再用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液制 0.01-0.05mg/ml的工作液。取 1ml 不同濃度的工作液，按測(cè)定蔗糖酶活 性同樣的方法進(jìn)行顯色， 比色后以逛密度值為縱 坐標(biāo)，葡萄糖為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。4.計(jì)算蔗糖酶活性以 24h 后 1g 土壤中含葡萄糖的 mg 數(shù)表示。葡萄糖 (mg)=a 100 a從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的葡萄糖 mg 數(shù) 4換算系數(shù)蔗糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定方法1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制a. 飽和苯甲

29、酸溶液的配制在潔凈的燒杯中加入適量蒸餾水， 慢慢加入少 量苯甲酸同時(shí)用玻璃棒攪拌， 直至苯甲酸溶解的 同時(shí)出現(xiàn)析出的苯甲酸晶體為止。b. 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的配制稱(chēng)取 500mg 葡萄糖溶解于適量苯甲酸飽和溶液中，并取 100ml 容量瓶用苯甲酸飽和溶液定容 （ 5mg/ml）。2. 操作步驟a. 取 11 支潔凈 20ml 玻璃管編號(hào) 0 10。b. 按下表加液編號(hào)： 0 1 2 34 5 6 7 8 9 10葡萄糖母液（ ml） 0 0.005 0.01 0.0150.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 飽和苯甲酸（ ml） 0.2 0.195 0.19 0.1

30、85 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13 葡萄糖濃度（ mg/ml） 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 吸光值（A508nm） 0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.006 1.176c. 在玻璃管中各加入 0.5ml3,5- 二硝基水楊 酸溶液，并立刻放入沸水浴中加熱 5min. 加熱后， 立刻將玻璃管在流動(dòng)自來(lái)水下冷卻 3min. 冷卻完 畢后，用蒸餾水定容至 5ml.d. 將顯色液在 508nm波長(zhǎng)下比色。 最大吸收峰

31、處的波長(zhǎng)為 500nm。一般情況下，選取最大吸收峰處的波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定可以提 高靈敏度，但在此波長(zhǎng)下 DNS 試劑也具有一定的吸光度 （DNS 試劑- 水曲線(xiàn) ） 。再者， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 顯色之前空白和待測(cè)液中 DNS 試劑的添加量是相同的， 但顯色期間由于部 分DNS 試劑與待測(cè)液中還原糖相結(jié)合， 從而造成測(cè)定吸光度時(shí)， 空白中 DNS 試劑含量大 于待測(cè)液中 DNS試劑含量。故 5 0 0 n m 下，D N S 試劑對(duì)測(cè)定結(jié)果干擾嚴(yán)重。結(jié)合葡 萄糖顯色液 - 水曲線(xiàn)可以看出，這種影響在 540nm 的情況下一直很顯著。故本實(shí) 驗(yàn)DNS 試劑 1最終確定的測(cè)定波長(zhǎng)選為 540nm，而不是 50

32、0nm（最大吸收波長(zhǎng) ）。土壤酶活性測(cè)定方法（老方法較詳細(xì)）土壤脫氫酶活性測(cè)定原理氯化三苯基四氮唑（ TTC ）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為 80mV 的氧化還原色素，溶于水 中成為無(wú)色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲臢（TPF ）， TPF 比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化， 所以 TTC 被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體， 植物根系中脫氫酶所引起的 TTC 還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋(píng)果酸得 到增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以 TTC 還原量能表示脫氫酶活性并作 為根系活力的指標(biāo)。測(cè)定步驟1 稱(chēng)取 4克鮮土于 50ml三角瓶中，加入4mL（TTC- 葡萄糖 -Tris緩沖溶液（ pH7

33、.6， 即 2ml 1%TTC-Tris 緩沖溶液， 2ml 1%葡萄糖 ），置 37暗室培養(yǎng) 24hr。2 取出后用少量甲醇提取后過(guò)濾，再用 50ml 容量瓶或比色管定容。3 濾液馬上用 485nm 波長(zhǎng)下分光光度計(jì)測(cè)定。附： pH7.6 Tris 緩沖液的配制：A： 0.2M 三-（羥甲基） -氨基甲烷溶液（ 1000 ml含 24.23克） B：0.2M HCl100 ml A+76.8ml B,加水稀釋至 400 ml，準(zhǔn)確調(diào)節(jié) pH 為 7.6。TPF 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取 10mg TPF溶于 250 ml甲醇中，得到 40 mg/L 的母液。從中吸取 0，1，2，3，4，5

34、ml于 50ml容量瓶中，用甲醇定容，得到 0，40，80，120，160，200ug TPF的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。土壤脲酶的測(cè)定方法（苯酚鈉次氯酸鈉比色法）、原理脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為 專(zhuān)性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活 性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。根際 土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性 表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可 以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與 苯酚次氯酸鈉

35、作用生成藍(lán)色的靛酚，來(lái)分析脲酶活性。二、試劑1）甲苯2）10% 尿素：稱(chēng)取 10g尿素，用水溶至 100ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（ PH6.7）：184g檸檬酸和 147.5g氫氧化鉀（ KOH ）溶于蒸 餾水。將兩溶液合并，用 1mol/LNaOH 將 PH 調(diào)至 6.7，用水稀釋定容至 1000ml。4）苯酚鈉溶液（ 1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀釋至 100ml（A 液），存于冰箱中； 27gNaOH 溶于 100ml 水 （B液）。將 A、B溶液保存在冰箱中。使用前將 A液、B液各 20ml混合， 用蒸餾水稀釋至 10

36、0ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至 活性氯的濃度為 0.9%， 溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 精確稱(chēng)取 0.4717g 硫酸銨溶于水并稀釋至 1000ml，得到 1ml含有 0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋 10 倍（吸取 10ml 標(biāo)準(zhǔn)液定容至 100ml） 制成氮的工作液（ 0.01mg/ml）。三、操作步驟稱(chēng)取 5g土樣于 50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加 10ml 10% 尿素溶液和 20ml PH 6.7 檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在 37恒溫箱培養(yǎng) 24小時(shí)。 培養(yǎng)結(jié)束后過(guò)濾， 過(guò)濾后取 1ml 濾液加入 50ml 容量瓶中， 再加 4ml苯酚鈉溶液

37、 和 3ml 次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。 20min 后顯色，定容。 1h 內(nèi)在分光光度計(jì) 與 578nm 波長(zhǎng)處比色。（靛酚的藍(lán)色在 1h 內(nèi)保持穩(wěn)定）。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：在測(cè)定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、 9、 11、13ml 氮工作液，移于 50ml 容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至 20ml。再加入 4ml 苯 酚鈉溶液和 3ml 次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。 20min 后顯色，定容。 1h 內(nèi)在分 光光度計(jì)上于 578nm 波長(zhǎng)處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。注意事項(xiàng) :1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其 他操作與

38、樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同， 以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的 土樣四、結(jié)果計(jì)算 ：以 24 小時(shí)后 1g 土壤中 NH3 N 的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性Ure）。Ure=（ a樣品 a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)） Vnm式中： a 樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的 NH3N 毫克數(shù)； a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的 NH3N 毫克數(shù)； a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的 NH3N 毫克數(shù)； V 為顯色液體積； n 為分取倍數(shù)， 浸出液體積吸

39、取濾液體積； m 表示烘 干土重土壤磷酸酶活性測(cè)定（磷酸苯二鈉比色法）一、原理測(cè)定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。前一 種通常稱(chēng)為有有機(jī)基團(tuán)含量法，是目前較為常用的測(cè)定磷酸酶的方法，后一種 稱(chēng)為無(wú)機(jī)磷含量法。研究證明：磷酸酶有三種最適 PH 值： 45、67、810。因 此，測(cè)定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶， 要提供相應(yīng)的 PH 緩沖液才能測(cè)出該 土壤的磷酸酶最大活性。測(cè)定磷酸酶常用的 PH 緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（ PH5.05.4）、檸檬酸鹽緩沖液（ PH7.0）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液 （ PH7.08.5）、 和硼酸緩沖液（ PH910）。磷酸酶測(cè)定時(shí)常用基

40、質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、 甘油磷酸鈉、 -或者 -萘酚磷酸鈉等?，F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1）緩沖液：（1）醋酸鹽緩沖液（ PH 5.0）0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27g C2H3O2Na.3H2O 溶至 1L. 取 14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 35.2ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液稀釋至 1L. （2）檸檬酸鹽緩沖液（ PH 7.0）0.1mol/L 檸檬酸溶液 19.2g C6H7O8 溶至 1L.0.2mol/L 磷 酸 氫 二 鈉 溶 液 53.63

41、g Na2HPO 4.7H 2O 或 者 71.7g Na2HPO 4.12H 2O 溶至 1L.取 6.4ml 0.1mol/L 檸檬酸溶液加 43.6ml 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液稀釋至 100ml.（3）硼酸鹽緩沖液（ PH 9.6）0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至 1L.0.2mol/L NaOH 溶液 8g NaOH 溶至 1L.取 50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加 23ml 0.2mol/L NaOH 溶液稀釋至 200ml. 2）0.5% 磷酸苯二鈉（用緩沖液配制） 3）氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：稱(chēng)取 0.125g 氯代二溴對(duì)苯醌亞胺，用 10m

42、l 96% 乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可 使用。4）甲苯5）0.3%硫酸鋁溶液 6）酚標(biāo)準(zhǔn)溶液酚原液：取 1g 重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至 1L，存于棕色瓶中。酚工作液（ 0.01mg/ml）：取 10ml 酚原液稀釋至 1L。 三、操作步驟稱(chēng) 5g 土樣置于 200ml 三角瓶中， 加 2.5ml 甲苯， 輕搖 15min 后，加入 20ml 0.5% 磷酸苯二鈉 （酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液； 中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液； 堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液） ，仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱， 37下培養(yǎng) 24h。然后 在培養(yǎng)液加入 100ml 0.3%硫酸鋁溶液并過(guò)濾

43、。吸取 3ml 濾液于 50ml 容量瓶中， 然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法顯色。用硼酸緩沖液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光光度計(jì)上 660nm 處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：取 0、1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于 50ml 容 量瓶中，每瓶加入 5ml 硼酸緩沖液和 4 滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀 釋至刻度， 30min 后，在分光光度計(jì)上 660nm 處比色。以顯色液中酚濃度為橫 坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。注意事項(xiàng) :1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其 他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土

44、樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同， 以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的 土樣四、結(jié)果計(jì)算以 24h 后 1g 土壤中釋放出的酚的質(zhì)量（ mg）表示磷酸酶活性 磷酸酶活性 =（a 樣品 a 無(wú)土 a 無(wú)基質(zhì)） V n m式中：a 樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的酚毫克數(shù)；a 無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的酚毫克數(shù)；a 無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的酚毫克數(shù)；V 為顯色液體積； n 為分取倍數(shù)，浸出液體積吸取濾液體積； m 表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測(cè)定（ 3,5- 二硝基水楊酸比色法） 一、原理 蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性

45、，如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土 壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的 還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的 3-氨基 -5-硝基水楊酸。顏色深度與還原 糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì) 8%蔗糖， pH5.5 磷酸緩沖液： 1/15M 磷酸氫二鈉（ 11.876g Na2HPO 42H2O溶于 1L蒸餾水中） 0.5ml加1/15M 磷酸二氫鉀（ 9.078g KH 2PO4溶于 1L 蒸餾水中） 9.5ml 即成，甲苯2 ）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ 1mg/mL ）預(yù)先將分析純葡萄糖置 8

46、0烘箱內(nèi)約 12 小時(shí)。準(zhǔn)確稱(chēng)取 50mg 葡萄糖于燒杯中， 用蒸餾水溶解后，移至 50mL 容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中 4保存期約一星期） 。 若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。3） 3,5- 二硝基水楊酸試劑（ DNS 試劑）稱(chēng) 0.5g 二硝基水楊酸， 溶于 20ml 2mol/LNaOH 和 50ml 水中，再加 30g 酒石酸鉀鈉， 用水稀釋定容至 100ml（保存期不過(guò) 7 天）。三、操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制分別吸 1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5mL 于試管中，再補(bǔ)加蒸 餾水至 1mL ，加 DNS 試劑 3m

47、L 混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng) 5min（從試管放入重新沸騰 時(shí)算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫， 以空白管調(diào)零在波長(zhǎng) 540nm 處比色 ，以 OD 值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（2）土壤蔗糖酶測(cè)定稱(chēng)取 5 g土壤，置于 50mL三角瓶中，注入 15ml 8%蔗糖溶液， 5ml pH 5.5 磷酸緩 沖液和 5 滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在 37下培養(yǎng) 24h。到時(shí)取出，迅速過(guò) 濾。從中吸取濾液 1ml，注入 50ml容量瓶中，加 3ml DNS 試劑，并在沸騰的水浴鍋中 加熱 5min，隨即將容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻 3min。溶液因生成 3-氨基 -5-硝基水楊

48、酸 而呈橙黃色， 最后用蒸餾水稀釋至 50ml ，并在分光光度計(jì)上于 508nm 處進(jìn)行比色。（為 了消除土壤中原有的蔗糖、 葡萄糖而引起的誤差， 每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 整個(gè)試驗(yàn) 需做無(wú)土壤對(duì)照； 如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值， 則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng) 的土樣。）四、結(jié)果計(jì)算： 蔗糖酶活性以 24h，1g 干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性 =（a樣品 a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)） nma 樣品、 a無(wú)土、 a 無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求的葡萄糖毫克數(shù)； 為分取倍數(shù)； m 表示烘干土重土壤纖維素酶活性測(cè)定（ 3,5- 二硝基水楊酸比色法）、原理纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壤的碳水化合物的重要組

49、分之一。在纖維素酶作 用下，它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡 萄糖。所以，纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個(gè)重要的酶。纖維素酶解所生成的還 原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的 3-氨基 -5-硝基水楊酸。顏色深度與 還原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。試劑1）甲苯2）1% 羧甲基纖維素溶液： 1g 羧甲基纖維素鈉，用 50%的乙醇溶至 100ml。3） pH5.5 醋酸鹽緩沖液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27.22g C2H3O2Na.

50、3H2O 溶至 1L.取 11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 88ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液混勻即成 PH 5.5 醋酸鹽緩沖 液.4）3,5-二硝基水楊酸溶液：稱(chēng) 1.25g 二硝基水楊酸，溶于 50ml 2mol/LNaOH 和 125ml 水中，再加 75g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至 250ml（保存期不過(guò) 7 天）， 5）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ 1mg/mL ）預(yù)先將分析純葡萄糖置 80烘箱內(nèi)約 12 小時(shí)。準(zhǔn)確稱(chēng)取 50mg 葡萄糖于燒杯中，用蒸 餾水溶解后，移至 50mL 容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中 4保存期約一星期） 。若該 溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。三

51、、操作步驟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)： 分別吸 1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至 1mL ，加 DNS 溶液 3ml 混勻，于沸騰水浴中加熱 5min， 取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng) 540nm 處比色，以 OD 值為縱坐 標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。稱(chēng) 10g 土壤置于 50ml 三角瓶中，加入 1.5ml 甲苯，搖勻后放置 15min，再加 5ml 1% 羧甲基纖維素溶液和 5ml pH5.5 醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在 37恒溫箱中培養(yǎng) 72h。 培養(yǎng)結(jié)束后，過(guò)濾并取 1ml 濾液，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

52、顯色法比色測(cè)定。 （為了消除土 壤中原有的蔗糖、 葡萄糖而引起的誤差， 每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土 壤對(duì)照； 如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值， 則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。 ）四、結(jié)果計(jì)算纖維素酶活性以 72h， 1g 干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。纖維素酶活性 =（a 樣品 a 無(wú)土 a 無(wú)基質(zhì)） n ma 樣品、 a 無(wú)土、 a 無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求的葡萄糖毫克數(shù)；n 為分取倍數(shù)； m 表示烘干土重過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定法）一、原理過(guò)氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中，是由生物呼吸過(guò)程和有機(jī)物的生物化學(xué) 氧化反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的，這些過(guò)氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒

53、害作用。與此同時(shí)， 在生物體和土壤中存有過(guò)氧化氫酶， 能促進(jìn)過(guò)氧化氫分解為水和氧的反應(yīng) （ H2O2 H2O+O2），從而降低了過(guò)氧化氫的毒害作用。土壤中過(guò)氧化氫酶的測(cè)定便是 根據(jù)土壤（含有過(guò)氧化氫酶）和過(guò)氧化氫作用析出的氧氣體積或過(guò)氧化氫的消 耗量，測(cè)定過(guò)氧化氫的分解速度，以此代表過(guò)氧化氫酶的活性。測(cè)定過(guò)氧化氫 酶的具體方法比較多，如氣量法：根據(jù)析出的氧氣體積來(lái)計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活 性；比色法：根據(jù)過(guò)氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來(lái)表征過(guò)氧 化氫酶的活性；滴定法：用高錳酸鉀溶液滴定過(guò)氧化氫分解反應(yīng)剩余過(guò)氧化氫 的量，表示出過(guò)氧化氫酶的活性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用高錳酸鉀滴定法。二、試劑2mol/L H 2SO4溶液:量取 5.43ml 的濃硫酸稀釋至 500ml，置于冰箱貯存 ;0.02mol/L 高錳酸鉀溶液： 稱(chēng)取 1.7g 高錳酸鉀， 加入 400mL 水中，緩緩煮沸 15min， 冷卻后定容至 500mL ，避光保存，用時(shí)用 0.1mol/L 草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L 草酸溶液：稱(chēng)取優(yōu)級(jí)純 H2