不同位置土壤中枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的比較

1、不同位置土壤中枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的比較摘要：從月季花下、草坪上及大樹下采集土壤，然后 對其進行分離得到枯草芽孢桿菌。通過對枯草芽苞桿菌利用 酪蛋白培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶能力的比較，發(fā)現(xiàn)月季花下土壤中分 離得到的枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力最強。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；蛋白酶；純化中圖分類號： S188 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1007-273X （2014）03-0012-02隨著飼用酶制劑應(yīng)用研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了 蛋白酶在動物營養(yǎng)上的獨特作用，蛋白酶也因此受到了越來 越多的關(guān)注。根據(jù)來源的不同，蛋白酶可分為動物源性蛋白 酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等 1 。其中微生物 蛋白

2、酶既有通過細菌（如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）培 養(yǎng)提取的，也有通過真菌（如黑曲霉、酵母）發(fā)酵提取的。 微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生產(chǎn)成本相對低廉，在多種 工業(yè)（如飼料、食品等）上得到了廣泛應(yīng)用。本試驗通過對 不同位置的新鮮土壤進行分離，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較高的 菌株，為微生物蛋白酶的研究奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 土壤試驗用 3 份新鮮土壤：采自黃淮學(xué)院某月季花下、草坪 上及大樹下，距土壤表層約10 cm。1.2 方法1.2.1 菌株分離 將土樣平攤于一干凈的四方紙上，從紙 的四角及中間各取適量的土樣，混勻。稱取 1.0 g 混勻土樣 與 20 mL 肉湯培養(yǎng)基于錐形瓶中混合，封口。

3、再將其放入80 C恒溫水浴鍋中加熱處理 10 min，然后于恒溫?fù)u床內(nèi)30 C, 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h。用接種環(huán)接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 C條件下培養(yǎng)24 h2， 3。1.2.2 革蘭氏染色 將上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落進行 涂片鏡檢。在已干燥的抹片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色 1min，水洗；加路戈碘液進行媒染 2 min，水洗；加95%乙醇 進行脫色30 s，水洗；加10倍稀釋的石碳酸復(fù)紅染液， 復(fù)染 1 min ，水洗；吸干、烘干，鏡檢。1.2.3 生化試驗（1 ）接觸酶試驗。用接種環(huán)取一小環(huán)符合上述要求的 菌落涂抹于已滴有 10%過氧化氫溶液的載玻片上， 觀察載

4、玻 片上是否有大量氣泡產(chǎn)生。（2）V-P 試驗。將符合上述要求的菌落接種于V-P 反應(yīng) 培養(yǎng)液中，37 C培養(yǎng)4 d后，取2 mL培養(yǎng)液和等量的 40%NaOH 溶液混合，充分振蕩后觀察培養(yǎng)液是否呈紅色。（3）水解淀粉試驗。取符合上述要求的菌落接種于淀 粉培養(yǎng)基上，于37 C培養(yǎng)4 d后，在平板上滴加盧氏碘液 （需鋪滿菌落） ，觀察平板是否呈藍色，菌落周圍有無無色 透明圈出現(xiàn)。（4）檸檬酸鹽試驗。將符合上述要求的菌落接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37 C培養(yǎng)4 d,觀察平板是否呈現(xiàn)藍色或 桃紅色。（5）分解酪素試驗。將符合各個生化鑒定結(jié)果的菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床機內(nèi)30 C、150 r

5、/min振蕩富集培養(yǎng)24 h。然后再將其置于 80C水浴鍋中加熱10 min。取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋為 10 4、10 5、 10 6。分別取 0.1 mL 菌液涂布于酪素培養(yǎng)基上。倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 C培養(yǎng)24 h。觀察酪素平板上菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，挑 H/C （透 明圈直徑/菌落直徑）比值大的菌種接入斜面培養(yǎng)基上。30 C 培養(yǎng)24 h,備用。1.2.4 菌種純化 平板劃線分離法在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 上分離純化挑選出的菌株。2 結(jié)果與分析2.1 菌種分離革蘭氏染色陽性；鏡檢結(jié)果為短桿狀、芽孢端生,形狀橢圓2.2 菌種鑒定生化試驗鑒定結(jié)果見表 1。有表 1 可見，該菌

6、對接觸酶 試驗、 V-P 試驗、水解淀粉試驗、檸檬酸鹽試驗均呈陽性。由表 2 可見，月季花下分離后菌株在酵素平板上的 H/C 值最大。該菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周圍所形成的 透明圈 H/C 結(jié)果見表 2。根據(jù)各項指標(biāo)的檢測結(jié)果，依照伯杰氏細菌鑒定手 冊，可以認(rèn)為篩選到的菌株為枯草芽孢桿菌 4 ，其中月季 花下純化的枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力最強，草坪上純化的 枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力次之，大樹下純化的枯草芽孢桿 菌產(chǎn)蛋白酶能力最弱。3 討論 催化蛋白質(zhì)水解的酶種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰 蛋白酶、 組織蛋白酶、 木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶等。 許多行業(yè)已開始大量利用蛋白酶，因為它既可

7、以節(jié)省時間， 又能改善勞動衛(wèi)生條件。 蛋白酶可用于蠶絲脫膠、 肉類嫩化、 酒類澄清等。 臨床上可作藥用， 如用胃蛋白酶治療消化不良， 用酸性蛋白酶治療支氣管炎；加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產(chǎn) 品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血漬和蛋白污物，但使 用時應(yīng)注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)，引 起皮疹、濕疹等過敏現(xiàn)象。本試驗通過對菌株分離、鑒定的研究，得到了產(chǎn)蛋白酶 的枯草芽孢桿菌，為進一步提高該菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力奠 定了基礎(chǔ)，在接下來的試驗中，計劃篩選出高產(chǎn)蛋白酶的枯 草芽孢桿菌菌株，并對其進行優(yōu)化，提高酶活力，增強穩(wěn)定 性，使其作為酶制劑盡快應(yīng)用于飼料添加劑產(chǎn)業(yè)。參考文獻：1 郭興華，益生菌一基礎(chǔ)與應(yīng)用M.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社， 2002.2 湯保貴， 徐中文， 張金燕， 等.枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件及對水質(zhì)的凈化作用J.淡水魚業(yè)