個(gè)體化裸鼠荷人肺癌腫瘤模型的建立

1、個(gè)體化裸鼠荷人肺癌腫瘤模型的建立王曉東 作者單位：300070 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（王曉東，李志，白悅）；天津市胸科醫(yī)院胸外科（孫大強(qiáng)）通訊作者 e-mail:sdqmd 孫大強(qiáng) 李 志 白 悅摘要 目的：建立人肺癌個(gè)體化可傳代組織塊動(dòng)物模型。方法：組織塊移植組將直徑2 mm的人肺癌新鮮標(biāo)本癌組織塊移植于balb/c裸鼠背部皮下組織內(nèi)，每例人肺癌新鮮標(biāo)本均移植入5只裸鼠體內(nèi)，成瘤成功者為第一代。取第一代移植瘤組織塊以相同方法移植于balb/c裸鼠背部皮下組織內(nèi)，成功者為第二代。重復(fù)上述傳代方法得到第三代移植瘤。將人肺癌細(xì)胞株a549、h1795分別移植于bacl/c裸鼠背部皮下組織內(nèi)，成瘤達(dá)

2、500 mm3后取癌組織塊。分別取實(shí)驗(yàn)組的原代人肺癌腫瘤及第一、二、三代移植瘤部分組織，及作為對(duì)照的細(xì)胞系移植瘤組織，固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋、切片、he 染色，光鏡下觀察比較其形態(tài)異同。結(jié)果：組織塊移植組瘤細(xì)胞不僅保留了人肺癌癌細(xì)胞的異型性，還保持原有排列結(jié)構(gòu)；而作為對(duì)照的細(xì)胞系移植瘤細(xì)胞失去了原有的排列結(jié)構(gòu)，僅保留了癌細(xì)胞的異型性。結(jié)論：利用不同患者的手術(shù)切除肺癌標(biāo)本所建立的裸鼠荷人肺癌腫瘤模型具有個(gè)體化特征，能夠?yàn)榉伟﹤€(gè)體化治療的研究提供有效工具。關(guān)鍵詞 癌, 非小細(xì)胞肺 移植, 異種 腫瘤移植 細(xì)胞系, 腫瘤 模型, 動(dòng)物 小鼠, 近交balb/c 人類 the estab

3、lishment of indivudal human lung cancer model by xenotransplant tumor mass in nude mousewang xiaodong ,sun da-qiang,li zhi,bai yuetianjin medical university graduate school,tianjin 300070,chinaabstract objective:to establish clinically relevant individuation nude mouse models of human non-small cell

4、 lung cancer,which can be stably passaged,so as to lay a foundation for the future individualized therapy study. methods: tumor implanting group: balb/c nude mouse subcutaneously injected in the back with diameter 2mm tumor derived from human operative specimens were killed when the tumor mass grown

5、 to 800mm3.this is the first generation.then,to establish the second generation, balb/c nude mouse were injected in the back with diameter 2mm tumor derived from first generation tumor mass.the same method redone to gain the third generation tumor. cell lines implanting group: balb/c nude mouse subc

6、utaneously injected in the back with 1106 human lung cancer cell lines a549 or h1795 were killed when the tumor mass grown to 500mm3.the tissue of primary human lung cancer 、first 、second 、third generation implanting tumor and the cell lines implanting group tumor were formalin-fixed、cut sections、he

7、 stained,and then compared with the morphology by lightmicroscope.results: the tumor cells of the tumor implanting group not only retains the atypia of cancer cells, but also keep original arrangement structure; the cell lines implanting group tumor cells lose their arrangement structure, keeping on

8、ly the atypia of the cancer cells. conclusion: using different surgical excision of lung cancer established human lung cancer tumor nude mice-model which have individual characteristics,this model can be useful for the future individualized therapy study in vivo. key words carcinoma, non-small-cell

9、lung transplantation, heterologous neoplasm transplantation cell line, tumor models, animal mice, inbred balb/c humans既往眾多的肺癌模型，尤其是移植瘤肺癌模型，是將人肺癌細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)傳代生長(zhǎng)，其移植的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、染色體數(shù)量、同工酶水平等仍保持不變，對(duì)臨床常用抗癌藥物敏感性也大致相同，所以常用來(lái)做疾病定性篩選及抗癌藥物的篩選1-2。然而，其肺癌細(xì)胞多來(lái)源于建系成功的細(xì)胞株，這些細(xì)胞株經(jīng)過(guò)多次體外傳代，雖然能夠穩(wěn)定表達(dá)其原代癌細(xì)胞的特性，但是否能代表腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的各種

10、特性值得商榷。加之可用于人肺癌細(xì)胞移植細(xì)胞系種類有限，且多來(lái)源于國(guó)外患者，與我國(guó)患者有人種差異，在強(qiáng)調(diào)腫瘤個(gè)體化治療的今天已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。近年國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于組織塊移植動(dòng)物模型建立的報(bào)道3-5。本研究以建立人肺癌個(gè)體化可傳代組織塊移植動(dòng)物模型為目的，以期為患者進(jìn)行個(gè)體化治療提供藥物篩選的有效工具，并為研究經(jīng)過(guò)各項(xiàng)治療后患者腫瘤細(xì)胞發(fā)生各種突變的情況和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。balb/c裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，先在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)12 d(空氣層流室飼養(yǎng)，室溫26 28 ，相對(duì)濕度50%)，以適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境，腫瘤移植時(shí)小鼠為46周齡，體質(zhì)量1520 g。

11、（2）個(gè)體化移植腫瘤來(lái)源。為天津市胸科醫(yī)院手術(shù)切除的人非小細(xì)胞肺癌新鮮標(biāo)本組織塊。（3）細(xì)胞株移植腫瘤來(lái)源。人肺癌細(xì)胞株a549、h1795購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。1.2 個(gè)性化人肺癌腫瘤組織塊種植方法 從手術(shù)切除的人肺癌新鮮標(biāo)本中切取直徑約1 cm左右組織塊，保存于加入青-鏈霉素雙抗的rpmi-1640培養(yǎng)液中，在標(biāo)本獲取6 h之內(nèi)進(jìn)行種植。超凈工作臺(tái)內(nèi)以rpmi-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗肺癌組織塊，用剪刀將組織塊修剪成直徑約2 mm的小塊，用25號(hào)接種針將其種植于balb/c 裸鼠背部皮下組織內(nèi)，每例人肺癌新鮮標(biāo)本均移植入5只裸鼠體內(nèi)，整個(gè)腫瘤組織塊的制備和種植在無(wú)菌條

12、件下進(jìn)行。1.3 移植后動(dòng)物飼養(yǎng)和種植腫瘤觀察 動(dòng)物種植腫瘤細(xì)胞后在無(wú)特定病原體(spf)條件下飼養(yǎng),被種植同一例肺癌患者標(biāo)本組織塊的5只裸鼠飼養(yǎng)于同一籠舍之內(nèi)。每日觀察接種部位腫瘤生長(zhǎng)情況，待發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)后，每隔3天測(cè)1次腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積v，v(mm3) = (dd2)/2，d為腫瘤表面最長(zhǎng)徑，d為腫瘤表面最短徑。1.4 腫瘤組織的傳代 待裸鼠皮下種植的人肺癌組織塊生長(zhǎng)至腫瘤體積達(dá)到800 mm3后，處死裸鼠剝?nèi)×鰤K，按1.3所述腫瘤種植方法再次植入裸鼠體內(nèi)，每例標(biāo)本仍移植入5只裸鼠體內(nèi)。此為第二代腫瘤組織塊。重復(fù)上述步驟，獲得第三代肺癌組織塊。1.5 腫瘤組織病理學(xué)觀察 取原代人肺癌

13、腫瘤及第一、二、三代移植瘤部分組織固定于10%福爾馬林中，石蠟包埋、切片、he 染色，光鏡下觀察。1.6 人肺癌細(xì)胞株種植方法 人肺癌細(xì)胞株a549、h1795，用含10小牛血清的dmem培養(yǎng)液，在37 、2.5co2及飽和濕度的恒溫箱培養(yǎng)，用0.25%.胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)占95%以上。在裸鼠背部皮下各接種1106個(gè)（約1 ml）腫瘤細(xì)胞，3周后成瘤，生長(zhǎng)至腫瘤體積達(dá)到500 mm3后，處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，固定于10%福爾馬林中，石蠟包埋、切片、he 染色，光鏡下觀察。2 結(jié)果2.1 裸鼠移植腫瘤的生長(zhǎng)情況 共取58例人肺癌新鮮標(biāo)本組織塊種植于裸鼠，有14例在

14、裸鼠體內(nèi)成瘤，建模成功率24.1%。第二代接種后14例腫瘤標(biāo)本有12例成功傳代。第三代接種后12例腫瘤標(biāo)本全部成功傳代。建模成功的人肺癌患者的臨床資料，見(jiàn)表1。表1 成功建立動(dòng)物模型的非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料tab 1 the clinical character of non-small cell lung cancer patients whose models were successfully established病例編號(hào)性別年齡（歲）分期病理診斷003男47t2n1m0，b鱗狀細(xì)胞癌004男45t2n1m0，b鱗狀細(xì)胞癌006男52t1n0m0，a腺癌012女72t2n0m0，b

15、腺癌015男75t1n0m0，a鱗狀細(xì)胞癌018女60t2n0m0，b腺癌019男54t1n0m0，a鱗狀細(xì)胞癌024男52t2n0m0，b鱗狀細(xì)胞癌027女45t1n0m0，a腺癌034女64t3n2m0，a腺癌038男58t1n2m0，a鱗狀細(xì)胞癌041男75t1n1m0，b鱗狀細(xì)胞癌045男49t2n2m0，a腺癌046男48t1n0m0，a鱗狀細(xì)胞癌2.2 移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化 組織塊和細(xì)胞系2種移植瘤均見(jiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，組織塊移植瘤細(xì)胞保持原有排列結(jié)構(gòu)，瘤細(xì)胞異型性不同，而細(xì)胞系移植瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失去了原有的排列結(jié)構(gòu)，只保持了細(xì)胞異型性的一致，見(jiàn)圖14。abcda：原代瘤組織； b：第1代

16、移植瘤組織； c：004號(hào)第2代移植瘤組織； d：第3代移植瘤組織圖1 no.004患者及其模型瘤組織(he200)a.original tumor of no.004 patient.b.first generation xenograft developed in balb/c nude mouse of no.004.c.second generation xenograft developed in balb/c nude mouse of no.004.d.third generation xenograft developed in balb/c nude mouse of no.

17、004.fig 1 he staining shows histopathologic similarity between the original human tumor of no.004 and its corresponding xenografts in models b、c and d( 200)圖2 h1795肺癌細(xì)胞系移植瘤組織(he200)fig2 he staining shows the tumor developed from cell line h1795(200).abcda:原代瘤組織; b:第1代移植瘤組織;c:第2代移植瘤組織; d:第3代移植瘤組織圖3 n

18、o.034患者及其模型瘤組織(he200)a.original tumor of no.019 patient. b.first generation xenograft developed in balb/c nude mouse of no.019. c.second generation xenograft developed in balb/c nude mouse of no.019. d. third generation xenograft developed in balb/c nude mouse of no.019fig3 he staining shows histopa

19、thologic similarity between the original human tumor of no.034 and its corresponding xenografts in models b、c and d.( 200).圖4 a549肺癌細(xì)胞系移植瘤組織(he200)fig 4 he staining shows the tumor developed from cell line a549(200).3 討論肺癌是對(duì)人類威脅最大的疾病之一。肺癌動(dòng)物模型的建立是研究癌變機(jī)制、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。利用肺癌細(xì)胞株種植于裸鼠及scid小鼠進(jìn)行異種腫瘤移植

20、已經(jīng)成為建立肺癌動(dòng)物模型的主要方法。目前已建成的各種肺癌細(xì)胞株，近年我國(guó)已建成很多腫瘤細(xì)胞系，并獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用6-7。但在使用這些細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)持特別審慎態(tài)度，主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長(zhǎng)期傳代中是否有發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長(zhǎng)期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的，另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化，其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動(dòng)。以近年建成的各種肺癌細(xì)胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認(rèn)建成了細(xì)胞系，這就很難保證細(xì)胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。本研究利用人肺癌組織塊種植的模型成瘤后的癌組織細(xì)胞不僅保留了原代癌細(xì)胞的異型性，還保留了細(xì)胞排列順序的

21、一致性。而細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和排列順序是其生物學(xué)行為的基礎(chǔ)，因此本研究的動(dòng)物模型對(duì)于進(jìn)一步的個(gè)體化治療的研究更有效。相對(duì)于其他疾病，腫瘤臨床治療的有效率目前仍然偏低。隨著人類基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)及腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，對(duì)腫瘤多成因、異質(zhì)性的特點(diǎn)有了更加全面的認(rèn)識(shí)。個(gè)體化治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的發(fā)展方向和最有效的手段8-9。但是，如何識(shí)別具有相同腫瘤發(fā)生部位、相同病理類型及病期的不同患者之間存在的差異成為實(shí)施個(gè)體化治療的主要障礙。本研究所建立的肺癌動(dòng)物模型，其腫瘤來(lái)源于不同患者手術(shù)切除的標(biāo)本，不再是某一個(gè)固定的細(xì)胞系。通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示生長(zhǎng)出來(lái)瘤塊的病理改變與人原發(fā)肺癌病理具有相同的組織學(xué)

22、特點(diǎn)和排列結(jié)構(gòu)，明顯優(yōu)于細(xì)胞系種植后所生長(zhǎng)的瘤塊，能夠更好地代表不同患者個(gè)體，具有個(gè)體化特征。建模成功的肺癌動(dòng)物模型，盡管其腫瘤來(lái)源于不同患者，但均能穩(wěn)定傳代，為今后進(jìn)行肺癌個(gè)體化治療的系列研究提供了一個(gè)有效的工具。本肺癌動(dòng)物模型的第一代建模成功率較低，其原因可能原因有：腫瘤自身的特性、腫瘤類型、組織分化、標(biāo)本處理方法等不同，裸鼠的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、感染情況等不同也有可能影響接種結(jié)果。另外，裸鼠雖然無(wú)t淋巴細(xì)胞，但其體液免疫仍較健全，隨裸鼠成熟或既往有感染使其免疫功能成熟或激活，也會(huì)導(dǎo)致建模成功率較低。目前，本肺癌模型尚需進(jìn)一步完善，建模成功率有待進(jìn)一步提高，傳代后的肺癌細(xì)胞尚需進(jìn)行更多的生物學(xué)檢測(cè)，

23、包括核型分析、電鏡觀察細(xì)胞一般結(jié)構(gòu)及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)檢測(cè)癌基因和抗癌基因等。通過(guò)這些檢測(cè)更好地證明其能夠代表不同患者個(gè)體，具有個(gè)體化特征。參考文獻(xiàn)1weiss b,shannon k.mouse cancer models as a platform for performing preclinical therapeutic trialsj. curr opin genet dev,2003, 13 (1):84-89. 2tanaka e，yamashita j，hayashi n，et ala pulmonary metastatic model of human non-small cell lung carcinoma cells that produce a neutrophil elastase-like molecule in severe combined immunodeficiency mice jchest，2003,123(4)：1248-1253 3 卓瑩，吳一龍，郭愛(ài)林，等.荷人肺癌小鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性初探j(luò).中國(guó)肺癌雜志，2010,13（6）：568-574.4