【doc】人肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)體會(huì)

1、人肝癌smmc-7721細(xì)胞培養(yǎng)體會(huì)人肝癌smmc一7721細(xì)胞培養(yǎng)體會(huì)王王月(甘肅中醫(yī)學(xué)院李應(yīng)東蘭州730060)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)i摘要】根據(jù)長(zhǎng)期培養(yǎng)人肝癌smmc一772l細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)出了一套培養(yǎng)細(xì)胞的方法,使得復(fù)蘇細(xì)胞成活率大為提高,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)【關(guān)鍵詞1人肝癌smmc-7721細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)方法l中圖分類(lèi)號(hào)】r73r文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼lai文章編號(hào)】1674-0742(20)0l(b)-0026-0l目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為很重要的生物技術(shù)之一,它是醫(yī)學(xué),新藥開(kāi)發(fā)等實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)技術(shù),其作用不容忽視.人肝癌smmc7721細(xì)胞屬于肝癌細(xì)胞系,現(xiàn)已廣泛用于藥物毒理,抗腫瘤等方面的研究,目

2、前關(guān)與人肝癌smmc-7721細(xì)胞的培養(yǎng)文獻(xiàn)還比較少,我們對(duì)于人肝癌smmc-7721細(xì)胞的培養(yǎng)條件和方法上進(jìn)行了探索,現(xiàn)總結(jié)出一些經(jīng)驗(yàn).1資料與方法1.1一般材料1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人肝癌smmc-7721細(xì)胞株由甘肅蘭州大學(xué)附屬二院泌尿研究所惠贈(zèng).1.1.2主要試劑dulbccosmodifiedeaglemedium(dmem)培養(yǎng)基:北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司磷酸鹽緩沖液(pbs):氯化鈉8.00g,十二水磷酸氫二鈉2.885g,氯化鉀0.2og,磷酸氫二鉀0.20,三蒸水配制,0.22m濾膜過(guò)濾除菌,ph7.27.4,4oc保存新生牛血清(nbcs):杭州四季青生物材料工程研究

3、所一20保存,使用前4c溶解,56%3滅活30min.胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(trypsinl:250,gibco公司)用pbs液配制成濃度為0.25%溶液,0.22um濾膜過(guò)濾除菌,4保存.青霉素,鏈霉素溶液:0.22m濾膜過(guò)濾除菌,4保存.1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器二氧化碳培養(yǎng)箱:bb16uv德國(guó)heraeus公司;超凈工作臺(tái):vs一1300l型,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司,倒置相差光學(xué)顯微鏡:ix71型,日本olympus公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋:dzw-4型,金壇市恒豐儀器廠;純凈水系統(tǒng):milliqbiocel美國(guó)millipore公司電熱恒溫干燥箱:風(fēng)熱式,101型,北京科偉永鑫實(shí)

4、驗(yàn)儀器設(shè)備廠;臺(tái)式滅菌器:tmo.j-2540型,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司.1.2方法1.2.1smmc一772l細(xì)胞的復(fù)蘇方法將凍存的細(xì)胞用鑷子捏住在提前預(yù)熱的37水浴鍋中快速搖晃將細(xì)胞解凍,整個(gè)過(guò)程一般不要超過(guò)2min,然后將細(xì)胞用尖吸管轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(復(fù)蘇的時(shí)候細(xì)胞最好不要分瓶),密度一般為110cell/ml為宜.緩慢加入81on體積的含10%胎牛血清,雙抗溶液(濃度一般保持0.1%)的dmem培養(yǎng)基(含4.0mml一谷氨酰胺,l000mg/l葡萄糖,l】0mg丙酮酸鈉經(jīng)0.1m無(wú)菌過(guò)濾)進(jìn)行稀釋,用尖吸管吹打50次將細(xì)胞吹散,培養(yǎng)瓶經(jīng)酒精擦拭就可以放入5%c0,37細(xì)胞培養(yǎng)箱

5、中培養(yǎng).剛復(fù)蘇的細(xì)胞比較脆弱在復(fù)蘇的24h內(nèi)最好不要觀察,以免晃動(dòng)影響細(xì)胞貼壁.24h后一般大多數(shù)貼壁細(xì)胞已經(jīng)貼壁,這時(shí)一定要換戍新鮮的培養(yǎng)液,不然凍存液中的dmso會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷,在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)48h后不除去dms0會(huì)使smmc-772l細(xì)胞喪失原來(lái)的細(xì)胞形態(tài)變圓從而停止生長(zhǎng).1.2.2smmc-7721細(xì)胞的傳代方法細(xì)胞一般鋪滿瓶底80%左右就可以進(jìn)行傳代了.smmc-772l細(xì)胞形態(tài)一般為花瓣?duì)?如果細(xì)胞數(shù)目過(guò)多未及時(shí)傳代可以觀察到細(xì)胞分為2層:上層為圓形細(xì)胞層,下層為花瓣形細(xì)胞層.我們實(shí)驗(yàn)室采用的傳代的具體方法如下:先用已過(guò)濾的預(yù)冷pbs溶液洗細(xì)胞2次,再加入0.25%的胰酶溶液

6、iml來(lái)回輕晃培養(yǎng)瓶用封口膜封口后在顯微鏡下觀察,待大部分細(xì)胞變圓后(一般2rain左右)立刻豎起培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫離胰酶溶液,經(jīng)酒精擦拭拿回超凈臺(tái),用尖吸管將胰酶吸出(此時(shí)盡量不要直接倒掉胰酶因?yàn)榧?xì)胞經(jīng)消化已經(jīng)貼壁不牢了,直接倒掉會(huì)損失一部分細(xì)胞).最后根據(jù)你要傳的瓶數(shù)加入相應(yīng)的培養(yǎng)基用尖吸管吸取培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶爬滿細(xì)胞的那面由上往下吹打.我們一般采取l:3的傳代方式,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,3d后長(zhǎng)滿瓶底.1.2.3smmc7721細(xì)胞的凍存方法在細(xì)胞生長(zhǎng)良好的時(shí)期一般為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期我們要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存,如果實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)污染可以提供健康的細(xì)胞來(lái)源.下面來(lái)談?wù)剝龃娴姆椒?凍存前首先我們要配置凍存液,我們采用的凍

7、存液的比例是lml的凍存液中含0.5ml的血清,0.4ml的新鮮培養(yǎng)基,o.1ml的dmso.剛配制的凍存液不能直接加入細(xì)胞內(nèi),因?yàn)閐mso會(huì)釋放出大量的熱會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷.具體方法如下:將生長(zhǎng)良好的smmc-7721細(xì)胞(約為80%90%致密度,濃度為110cell/ml)先用pbs溶液洗2次,用0.25%的胰酶如前面所述的方法將細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)移入離心管中800轉(zhuǎn)離&,5rain,用尖吸管吸去上清,加入已配置好的凍存液,最后將細(xì)胞吹散移入凍存管中封口,標(biāo)記好細(xì)胞的種類(lèi)及凍存日期,先放入4冰箱10rain再轉(zhuǎn)入-2030rain,然后放入一80冰箱過(guò)夜,最后取出放入液氮槽中長(zhǎng)期貯

8、存.如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有液氮罐,可以在4冰箱放30rain轉(zhuǎn)入-202h最后放入一80冰箱,這樣貯存方法可以貯存半年左右.凍存后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間可以拿出來(lái)復(fù)蘇一瓶,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況.作者簡(jiǎn)介:王珥(1984一):女,甘肅中醫(yī)學(xué)院在讀碩士,研究方向:中醫(yī)藥防冶心血管疾病.李應(yīng)東(1962):男,博士,研究方向:中醫(yī)藥防治心血管疾病及中藥抗輻射研究.26中外醫(yī)療o(wú)hlnaforeignmedicaltreatment基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)chlnaforelgnmeoical2討論2.1復(fù)蘇是否采用離心的方法有些文獻(xiàn)_2報(bào)道細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)采用用離心的方法去掉凍存液,鑒于剛復(fù)蘇的細(xì)胞很脆弱離心會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷,故

9、認(rèn)為復(fù)蘇時(shí)不離心,第2天換液為佳,因?yàn)?0%的dmso短期并不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響,經(jīng)此方法復(fù)蘇的smmc一7721細(xì)胞存活率較高一般達(dá)80%以上.2.2消化方法的改進(jìn)消化時(shí)如果單純用胰酶消化時(shí)間很難把握,若消化過(guò)度,細(xì)胞不容易貼壁,48h后仍不貼壁示為死細(xì)胞.若消化不完全用尖吸管吹打細(xì)胞很難吹下細(xì)胞.長(zhǎng)時(shí)間吹打也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷,這樣傳代還會(huì)引起每瓶細(xì)胞數(shù)目不均一,用pbs洗后消化時(shí)間易于掌握,提高細(xì)胞的活力.2.3凍存液的配制方法改進(jìn)以往相關(guān)資料中報(bào)道凍存液里含90%的培養(yǎng)液(含血清20%)和10%的dms0,由于細(xì)胞凍存會(huì)使細(xì)胞變的脆弱活力下降,應(yīng)當(dāng)加大血清的含量以保證復(fù)蘇后的細(xì)胞活力較好,

10、復(fù)蘇的成功率較高,目前也有學(xué)者采用9o%的血清加lo%的dmsopo成凍存液認(rèn)為這樣供給細(xì)胞更多的營(yíng)養(yǎng)會(huì)更利于復(fù)蘇后細(xì)胞的成活.2.4復(fù)蘇后細(xì)胞不貼壁的原因分析復(fù)蘇后的貼壁細(xì)胞24h后80%以上的細(xì)胞都會(huì)貼壁,不貼壁的細(xì)胞可能已經(jīng)死亡,主要有以下3方面的原因:(1)凍存前的細(xì)胞已經(jīng)存在污染;(2)凍存方法不正確主要可能是加入血清過(guò)少或者凍存溫度時(shí)間錯(cuò)誤;(3)細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)速過(guò)高或細(xì)胞貼壁后未及時(shí)去除凍存液從而對(duì)細(xì)胞造成損傷.一般smmc772l細(xì)胞在復(fù)蘇后4d左右貼壁率達(dá)90%以上,就可進(jìn)行傳代,傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)較迅速,3d左右基本可以鋪滿瓶底,經(jīng)過(guò)2,3次傳代細(xì)胞穩(wěn)定后,生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)就可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臨床毒理性試驗(yàn)研究,細(xì)胞核型分析,及提取總蛋白進(jìn)行蛋白印記分析等各種操作.3總結(jié)在人肝癌smmc一7721細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最為關(guān)鍵的技術(shù)還是無(wú)菌操作,一切的步驟都建立在其基礎(chǔ)之上.對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中所接觸的試劑,液體,器皿,均要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒,無(wú)菌觀念要貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)的始終,不可松懈.參考文獻(xiàn)1張卓然.實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)m.北京:人民衛(wèi)生出版社,