循環(huán)腫瘤標志物CTC檢測技術(shù)在肺部小結(jié)節(jié)診斷中的最新進展-培訓課件講解

1、循環(huán)腫瘤標志物（CTC）檢測技術(shù)在 肺部小結(jié)節(jié)診斷中的最新進展 格諾生物格諾生物 劉雙劉雙 Lung Cancer in Solid Tumor in China LDCT篩查降低肺癌死亡率 NLST research team. NEJM, 2011 胸部CT篩查與過度診療的悖論 大部分非實性成分的結(jié)節(jié)為良性疾 病 26.2% 自行消失 僅3% 確診為肺癌 將所有肺部結(jié)節(jié)計算在內(nèi)，假陽性率 為21.8%-26.6%左右 Pinsky FR, et al. Ann Intern Med, 2015 比較了兩個大型臨床研究的假陽性率 NEJM發(fā)表的NLST研究中假陽性率第一次篩查為26.6%，第

2、二次篩查 為21.8% 如何解決？ 第1-3次胸部CT篩查相比，第4次行 胸部CT時 I期肺癌的比例下降20% 如何解決？ PET-CT對于肺部良性結(jié)節(jié)，假陽性 率約45% Veronesi G, et al. Ann Int Med 2012 如何解決？ 創(chuàng)傷性檢查 不良反應大 部分患者無法耐受 肺癌病理活檢局限性 成本高 術(shù)后并發(fā)癥 對于部分年老或合并基礎(chǔ)疾 病的患者 如何解決: 能否有更敏感的腫瘤標志 物來幫助診斷 液態(tài)活檢在肺癌中的應用液態(tài)活檢在肺癌中的應用 治療策略 事件 肺癌待查 輔助診斷 早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥 復發(fā)監(jiān)測 治療方案選擇 療效評估 耐藥機理 新藥研發(fā) 治療策略 事

3、件疑似肺癌 輔助診斷 早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥 復發(fā)監(jiān)測 治療 方案 選擇 耐藥機理 新藥研發(fā) CTC的臨床應用價值 療效 評估 CTC(數(shù)量） (負向富集+靶向PCR） ctDNA (基因變異） 1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015 什么是循環(huán)腫瘤細胞（什么是循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell， CTCCTC）？）？ 腫瘤釋放如外周血中腫瘤釋放如外周血中CTCsCTCs數(shù)量的多少數(shù)量的多

4、少 ，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)，可間接反應腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài) CTCCTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細胞特征 的腫瘤細胞和不具有干細胞特征的腫瘤細胞， 均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循 環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell）CTC1 CTCCTC有轉(zhuǎn)移有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs ，稱之為DTC（disseminated Tumor Cell ），只有由具有干細胞特征干細胞特征的DTC所形成形成 的微轉(zhuǎn)移灶的微轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識別逃避免疫識別才可能發(fā)展成 為腫瘤遠處轉(zhuǎn)移2 CK+ cells HER-2+ cells 第9周的乳腺管組織切片 ：乳腺管周圍

5、非典型性增 生 第30周的腫瘤組織切片 ：新生的腫瘤上皮細胞 形成牙槽并侵襲周圍基 質(zhì) 什么時候可以檢測到CTC？ 早期腫瘤外周血中即可檢出CTC W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007 早期腫瘤外周血中即可檢出CTC l表達中等量FR的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面 l移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞 l移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升 l在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象 CTC富集技術(shù) 密

6、度與大小 免疫磁珠（負向富集 or 陽性富集) 微流體 CTC 檢測方法 CTC檢測技術(shù) 靶向PCR 免疫熒光 普通PCR =+ “方法”“收獲”“垃圾” 蟹 餌 沒水了， 我們躲不了了 放 水 負向富集負向富集 優(yōu)勢：回收率100% 劣勢：純度略低 正向富集正向富集 優(yōu)勢：純度高 劣勢：回收率低（漏掉CTC） 幸好沒貪嘴， 我們逃了 “方法”“收獲”“垃圾” 沒水了， 我們躲不了了 放 水 負向富集負向富集 優(yōu)勢：回收率100% 劣勢：純度略低 大小富集（大小富集（ISETISET ）優(yōu)勢：簡單 劣勢：漏掉小的CTC細胞 幸好沒吃胖， 我們逃了 網(wǎng) 篩 CytoploRare FR靶向PCR

7、 CTC檢測技術(shù) 負向富集靶向PCRFR陽性靶標 l肺癌細胞FR(葉酸受體）高 度表達 lCTC：FR=1:50萬 lEMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度 l其他血細胞不表達FR lCTC回收率接近100% l磁珠富集易操作和自動化 l靈敏度超高靈敏度超高，負向富集即可檢測 l信號二次放大，1: 1012倍放大 l無需人工經(jīng)驗判讀，結(jié)果客觀準確 l可實現(xiàn)CTC的定量 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 格諾格諾CytoploRare 靈敏度最高的檢測技術(shù) l 特異性DNA PCR擴增-提高敏感性 l FR靶向：高特異性探針 l 1 CTC in 6,000,000（可在600萬個背景細胞中

8、檢測出一個CTC） CytoploRare l 敏感性 l 特異性 l 可重復性 l 臨床應用便捷性 CytoploRare l 敏感性 l 特異性 l 可重復性 l 臨床應用便捷性 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性 1個CTC信號 放大1012倍 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 敏感性試驗：1ctc in 1,200,000白細胞 Jiatao Lou, et al. Plos One 2013 l 將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107） l FR靶向PCR CTC檢測技術(shù)的回收率接

9、近100%，且呈線性分布 l檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬 摻入細胞數(shù)量摻入細胞數(shù)量( (個個) )復管復管1 1復管復管2 2復管復管3 3檢測均檢測均 值值 檢出細胞數(shù)檢出細胞數(shù)( (個個) )回收率回收率(%)(%)平均回收率平均回收率(%)(%)R R 600571.52 565.13 586.37 574.34 584.12 97.35 98.75 0.9990.999 8 8 200198.93 192.81 185.90 192.55 192.46 96.23 5056.56 52.07 50.80 53.14 49.44 98.89 59.9

10、0 9.26 10.58 9.91 5.09 101.87 0 05.00 5.44 4.40 4.95 0.00 / l 將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107） l 檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 敏感性試驗：1ctc in 6,000,000白細胞 CytoploRare l 敏感性 l 特異性 l 可重復性 l 臨床應用便捷性 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術(shù) FR（葉酸受體，高度特異性的靶向探針） l 特異性高：特異性高：加入FR靶向探針前，

11、加入高濃度葉酸封閉細胞表面的葉酸 受體，檢測結(jié)果為陰性 l 背景表達：背景表達：去除FR靶向探針，僅保留 特異性DNA片段，與保留FR靶向探針 相比，檢測結(jié)果一致，提示背景可能為 特異性DNA片段所致的固定值 Jiatao Lou, et al. Plos One 2013 2004 Cell Search: 乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低 2011 Cell Research: 采用的抗體采用的抗體(EpCAM)對對 EMT細胞特異性差細胞特異性差，而肺癌細胞轉(zhuǎn)移入 血需要EMT的過程 EpCAM陰性細胞中，存在大量CTC Cell Research系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子） 做

12、為探針 研究證實，EpCAM陰性的細胞中也存在CTC Jiatao Lou, et al. Plos One 2013 l 有報道，部分激活的巨噬細胞 存在FR的高表達1 l 臨床前研究證實，這部分巨噬 細胞很少在正常人的外周血中 出現(xiàn)2 l 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬 細胞后，CTC的檢測結(jié)果無明 顯改變3 1、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 技術(shù) 巨噬細

13、胞（可能存在FR表達）不影響檢測結(jié)果 CytoploRare l 敏感性 l 特異性 l 可重復性 l 臨床應用便捷性 CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 技術(shù) 同一患者重復檢測，可重復性高 CytoploRare l 敏感性 l 特異性 l 可重復性 l 臨床應用便捷性 3mL血6個小時得到報告 檢測流程檢測流程 肺癌領(lǐng)域，CTC檢測技術(shù)對比 CytoploRare （格諾） CellSearchCyttelTM （北京萊爾） CanpatrolTM （益善） CTC-Biopsy （武漢友之友) 核心技術(shù) 免疫磁珠負向富集 靶向配體PCR技術(shù) 流式正向富集技術(shù)熒光 標記 免

14、疫磁珠負向富集、 Fish技術(shù) ISET（濾膜） 原位雜交RNA分析 ISET（濾膜) 熒光標記 特異性 88%80%83%75%70% 靈敏度 80% 30% 腺癌：46%30%30% 自動化 半自動全自動半自動半自動全自動 血樣體積 3mL 7.5mL4mL5mL10mL 適應癥 早、中和晚期早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結(jié)直腸癌、 前列腺癌 晚期肺癌、胰腺癌、 乳腺癌 晚期癌腫晚期癌腫 早期（I期） 敏感性 68% 0%20%(2/10)未報道未報道 中晚期敏 感性 89%25%（22/87)61%-88%30%40% 報告時間6h/12樣本樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天

15、 可視化否否是是是是 1210例受試者 肺癌 560例 肺部良性疾病 350例 其他腫瘤 (150 例) 肝癌 30例 結(jié)直腸癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例 331例A A 100例B B 50例C C（21例DD) 79例D D A: 基線CTC檢測 B：術(shù)前術(shù)后CTC監(jiān)測 C：一線含鉑雙藥化療中CTC監(jiān)測 D：基線CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE檢測 300例A A 50例D D 健康人 150例 100例A A 50例D D 150例A A 非動態(tài)研究非動態(tài)研究 肺癌 560例A A 肺部良性疾病 350例A A 健康人 150例A A 動態(tài)監(jiān)

16、測研究動態(tài)監(jiān)測研究 非小細胞肺癌 100例B B 50例C C 對比研究對比研究 肺癌 100例D D 肺部良性疾病 50例D D 健康人 50例D D 腫瘤特異性研究腫瘤特異性研究 其他腫瘤 150例A A FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術(shù)檢測技術(shù) 臨床試驗設(shè)計（1210例, 全國肺癌CTC研究最大樣本量 ） Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015 參加單位： 上海市肺科醫(yī)院 上海市胸科醫(yī)院上海市胸科醫(yī)院 醫(yī)科院腫瘤醫(yī)

17、院 特征特征例數(shù)例數(shù)(%)(%) 肺癌（肺癌（n=560n=560） 年齡（平均值，范圍）59.3歲(21-79歲) 性別（男性/女性）349/211 TNMTNM分期分期 期期150(26.8%)150(26.8%) 期48(8.6%) 期157(28.0%) 期205(36.6%) 病理亞型病理亞型 非小細胞肺癌465(83.0%) 肺腺癌320(68.8%) 肺鱗癌107(23.0%) 大細胞肺癌5(1.1%) 肺腺鱗癌1(0.2%) 其他非小細胞肺癌32(6.9%) 小細胞肺癌81(14.5%) 其他肺癌14(2.5%) 肺部良性疾病（肺部良性疾?。╪=350n=350） 42 患者特

18、征 Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015 FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術(shù)檢測技術(shù) 葉酸受體陽性CTC作為肺癌診斷的標志物 43 最大樣本量最大樣本量CTCCTC檢測數(shù)據(jù)檢測數(shù)據(jù) CutoffCutoff： 8.70 CTC Units/3mL 敏感性：敏感性：79.6%79.6% 特異性：特異性：88.2%88.2% Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. T

19、ransl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015 AUC: 0.8797 FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC檢測技術(shù)檢測技術(shù) 敏感性高 I期肺癌敏感性67.2%67.2% NSCLC患者與對照組的CTC 、NSE、CEA、CA125、 Cyfra21-1、SCC-AgROC曲 線分析 不同標志物在NSCLC和I期 NSCLC患者中的靈敏度 不同標志物在對照組的特異度 檢測方法cutoff值特異度（%）約登指數(shù)I期NSCLC靈敏度（%）AUC（95%CI） CTC8.64/ml84.10.573 67.2 0.823 (0.773-0.87

20、4) NSE18 ng/ml95.90.0554.60.585 (0.495-0.675) CEA5 ng/ml94.90.2518.50.76 (0.69-0.83) CA12535 U/ml97.60.1754.60.505 (0.417-0.592) Cyfra21-13.3 ng/ml900.35232.30.716 (0.615-0.816) SCC-Ag1.5 ng/ml93.80.1512.30.624 (0.535-0.713) FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-Ag對NSCLC和早期NSCLC患者的診斷效率 Yue Yu, et al. T

21、ransl Oncol 2013 1cm肺癌總體敏感性: 62.5%62.5% 患者編號患者編號CTC Units/3mL病理診斷病理診斷TNM分期分期臨床分期臨床分期-整理整理nodule diameter（CT） 1 10.53 肺腺癌T1aN0M00.3 2 0.04 肺腺癌T1N0M00.3 3 3.83 肺腺癌T1N0M00.5 4 8.78 肺腺癌tisTis0.5 5 8.77 肺腺癌T1aN0M00.6 6 3.93 肺腺癌T1N0M00.7 7 3.98 肺腺癌T2aN0M00.8 8 4.84 肺腺癌T1N0M00.8 9 10.32 肺腺癌T1aN0M01 10 13.5

22、5 肺鱗癌T1N0M01 11 6.29 肺腺癌T1aN0M01 12 12.65 肺腺癌T1N0M01 13 14.999074肺腺癌T1aN0M00.3 14 2.5497534肺腺癌T1aN0M00.5 15 6.2322726肺腺癌T1aN0M00.5 16 11.312907肺腺癌T1aN0M00.6 17 14.444199肺腺癌T1aN0M00.6 18 7.1141741肺腺癌T1aN0M00.7 19 11.134588肺腺癌T1N0M00.7 20 11.56小細胞肺癌T2aNxM00.7 21 13.461248肺腺癌T1aN0M00.7 22 10.009388肺腺癌T

23、1aN0M00.8 腫瘤大小CT特異性（） CTCTC特異性（） 30 mm (n134）59.794 20-30 mm (n44 )65.995.5 10-20mm (n69 )55.192.8 10mm (n21)61.995.2 CTC聯(lián)合CT可以大大提高小結(jié)節(jié)診斷的特異性 CTC輔助CT可以將小結(jié)節(jié)的判別假陽性率降低到10% Lou JT, Wang L, et al In submission 上海市胸科醫(yī)院：病例一 腫瘤標志物腫瘤標志物檢測值檢測值結(jié)果結(jié)果正常值正常值 CTC 10.45CU/3mL10.45CU/3mL升高升高 8.7 CEA1.29ng/mL正常0-10 CYFRA21- 1 3.26ng/mL正常0-3.3 NSE13.0ng/mL正常0-20 SCCA0.9ng/mL正