高效液相色譜-檢測器

1、高效液相色譜高效液相色譜 檢檢 測測 器器 侯建軍侯建軍 檢測器檢測器 是高效液相色譜儀是高效液相色譜儀 的核心部件，他負(fù)責(zé)把從色譜的核心部件，他負(fù)責(zé)把從色譜 柱分離出來的各組分快速、準(zhǔn)柱分離出來的各組分快速、準(zhǔn) 確的檢測出來，實(shí)現(xiàn)定性、定確的檢測出來，實(shí)現(xiàn)定性、定 量分析。量分析。 檢測器的分類檢測器的分類 v1、 紫外可見吸收檢測器紫外可見吸收檢測器(UV) v2 、光電二極管陣列檢測器、光電二極管陣列檢測器 ( PDA) v3 、熒光檢測器、熒光檢測器( FD) v4 、示差折光檢測器、示差折光檢測器( RID) v5 、電化學(xué)檢測器、電化學(xué)檢測器( ED) v6 、化學(xué)發(fā)光檢測器、化學(xué)

2、發(fā)光檢測器( CD) v7 、蒸發(fā)光散射檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 紫外可見吸收檢測器紫外可見吸收檢測器 (ultravioletvisible detector，UV) 紫外可見吸收檢測器(UVD)是HPLC中應(yīng)用最廣泛的 檢測器，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。 屬于選擇性檢測器。 1 、特點(diǎn)特點(diǎn)：靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，波長 可選，對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感，適用于梯 度洗脫，對(duì)強(qiáng)吸收物質(zhì)檢測限可達(dá)10-9g/ml以下，檢 測后不破壞樣品，可用于制備，并能與多種檢測器串 聯(lián)使用。工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計(jì)相似，也 就是裝有流通池的紫外可見分光光度計(jì)。 2、

3、結(jié)構(gòu)與原理結(jié)構(gòu)與原理：紫外吸收檢測器常用氘燈作光 源，氘燈則發(fā)射出紫外-可見區(qū)范圍的連續(xù)波長， 并安裝一個(gè)光柵型單色器，其波長選擇范圍寬 (190nm800nm)。 它有兩個(gè)流通池，一個(gè)參比池，一個(gè)測量池。光 源發(fā)出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都 通過純的均勻溶劑，則它們在紫外波長下幾乎無 吸收，光電管上接受到的輻射強(qiáng)度相等，即無信 號(hào)輸出。當(dāng)組分進(jìn)入測量池時(shí)，吸收一定的紫外 光，使兩光電管接受到的輻射強(qiáng)度不等，即有信 號(hào)輸出，輸出信號(hào)大小與組分濃度有關(guān)。 可變波長紫外檢測器 固定波長紫外檢測器 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 紫外/可見光檢測器的光路系統(tǒng)，由提供190nm600nm 寬帶光譜，光線徑直射

4、到上，衍射的單色光射到 ，被分成兩束光線，一束經(jīng)流通池后照射到 光電池上，另一束經(jīng)參比池照射到光電池上，光電池把光 能量轉(zhuǎn)換成微小電流信號(hào)，光柵由一臺(tái)微機(jī)控制的步進(jìn)電機(jī)精 確地驅(qū)動(dòng)以改變波長。如圖所示： D 氘燈氘燈 光門光門 波波 長長 調(diào)調(diào) 節(jié)節(jié) 桿桿 凹面光柵凹面光柵 半透鏡半透鏡 流通池流通池 光電池（測量）光電池（測量） 光電池（光電池（參比參比） 暗盒暗盒 單單 色色 器器 光源光源 步進(jìn)電機(jī)步進(jìn)電機(jī) 半透反光鏡半透反光鏡 檢測池檢測池 參比池參比池 光光 /電轉(zhuǎn)換電轉(zhuǎn)換 前置放大器前置放大器 A/D CPU 時(shí)鐘時(shí)鐘并行口并行口 訊號(hào)輸出訊號(hào)輸出 (積分積分/記錄記錄) 鍵鍵 盤

5、盤顯示屏顯示屏 直流直流 電源電源 變壓器變壓器交流電源交流電源 冷卻風(fēng)機(jī)冷卻風(fēng)機(jī) 紫外紫外/可見光檢測器系統(tǒng)原理圖可見光檢測器系統(tǒng)原理圖 3、局限：對(duì)紫外吸收差的化合物如不含不飽和鍵 的烴類等靈敏度很低。 流動(dòng)相的選擇受到一定限制，紫外吸收大的溶劑不 能做流動(dòng)相。每種溶劑都有截止波長，當(dāng)小于該截 止波長的紫外光通過溶劑時(shí)，溶劑的透光率降至 10%以下，因此，流動(dòng)相的截止波長不能大于紫外 吸收檢測器的工作波長。 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 (photodiode array detector， PDA ) 紫外檢測器的重要進(jìn)展紫外檢測器的重要進(jìn)展 ，也稱快速掃描紫外檢測器， 1、

6、特點(diǎn)：、特點(diǎn)： 靈敏度比紫外檢測器高靈敏度比紫外檢測器高 ，噪音，噪音 低低 ，線性范圍寬，線性范圍寬 ，對(duì)流速和溫度的波動(dòng)不，對(duì)流速和溫度的波動(dòng)不 靈敏，適用于梯度洗脫及制備色譜。靈敏，適用于梯度洗脫及制備色譜。 2、原理與結(jié)構(gòu)、原理與結(jié)構(gòu)： 二極管陣列檢測器光路示意圖二極管陣列檢測器光路示意圖 氘燈氘燈 消色差透鏡消色差透鏡斬光器斬光器流通池流通池 載液載液 全息光柵全息光柵 3、局限：局限：對(duì)紫外吸收差的化合物靈敏度很對(duì)紫外吸收差的化合物靈敏度很 低。流動(dòng)相的選擇受到一定限制，紫外吸收低。流動(dòng)相的選擇受到一定限制，紫外吸收 大的溶劑不能做流動(dòng)相。二極管陣列少的話大的溶劑不能做流動(dòng)相。二極

7、管陣列少的話 熒光檢測器熒光檢測器 (fluorescence detector， FD) 一般包括激發(fā)光源、選擇激發(fā)波長的單色器、檢測 池、選擇發(fā)射波長的單色器及檢測發(fā)光強(qiáng)度的光電 轉(zhuǎn)換系統(tǒng)等基本組件?？煞譃楣潭úㄩL熒光檢測器 （用多個(gè)率光片作單色器）和熒光分光檢測器（用 光柵作單色器）兩大類。 1、特點(diǎn)：、特點(diǎn)： 靈敏度極高 ，能達(dá)到 10-12g/ml ，有選 擇性，可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的 物質(zhì)可通過化學(xué)衍生法生成熒光衍生物，適用于痕量 分析。 2、原理與結(jié)構(gòu)：、原理與結(jié)構(gòu)：由光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)由光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā) 光單色器后，得到所需波長的激發(fā)光。通過檢光單色器后

8、，得到所需波長的激發(fā)光。通過檢 測池的激發(fā)光部分被樣品吸收，并使其被激發(fā)測池的激發(fā)光部分被樣品吸收，并使其被激發(fā) 后發(fā)射出熒光。在經(jīng)選擇發(fā)射波長的單色器分后發(fā)射出熒光。在經(jīng)選擇發(fā)射波長的單色器分 光后，單一波長的發(fā)射光被送至光電檢測器進(jìn)光后，單一波長的發(fā)射光被送至光電檢測器進(jìn) 行檢測。由于吸光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，行檢測。由于吸光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比， 光源應(yīng)具有高強(qiáng)度、連續(xù)、平滑、穩(wěn)定的輻射光源應(yīng)具有高強(qiáng)度、連續(xù)、平滑、穩(wěn)定的輻射 輸出功能。輸出功能。 熒光檢測器 氘燈 激發(fā)單色器 發(fā)射單色器 光電倍增管 光二極管（UV） 樣品流通池 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 光 源 檢 測 器 濾光片 檢測室 濾

9、光片 常見熒光檢測器光路圖常見熒光檢測器光路圖 3、局限：、局限：只能適合于能產(chǎn)生熒光的物只能適合于能產(chǎn)生熒光的物 質(zhì)（或通過衍生化能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)）質(zhì)（或通過衍生化能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)） 的檢測。其線性范圍不如紫外檢測器寬。的檢測。其線性范圍不如紫外檢測器寬。 示差折光檢測器示差折光檢測器 (differential refractive Index detector， RID) 是一種濃度型通用檢測器，對(duì)所有溶質(zhì)都有是一種濃度型通用檢測器，對(duì)所有溶質(zhì)都有 響應(yīng)響應(yīng)，應(yīng)用較廣，應(yīng)用較廣?？煞譃榉瓷湫停ǜ鶕?jù)?？煞譃榉瓷湫停ǜ鶕?jù) Fresnel定律）、折射型（根據(jù)定律）、折射型（根據(jù)Snell定律）

10、定律） 和干涉型三種類型。和干涉型三種類型。 1、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：靈敏度高、噪聲小、運(yùn)行高度靈敏度高、噪聲小、運(yùn)行高度 穩(wěn)定、折射率范圍寬、穩(wěn)定、折射率范圍寬、 操作簡單、方便。操作簡單、方便。 2 、原理與結(jié)構(gòu)：、原理與結(jié)構(gòu)：此檢測器是基于連續(xù)此檢測器是基于連續(xù) 測定樣品流路和參比流路之間折射率的變測定樣品流路和參比流路之間折射率的變 化來測定樣品的含量。光從一種介質(zhì)進(jìn)入化來測定樣品的含量。光從一種介質(zhì)進(jìn)入 另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不 同就會(huì)產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相同就會(huì)產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相 的折光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差的折

11、光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差 愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢 測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。 示差折光檢測器原理圖 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 3、局限：、局限：不如紫外檢測器敏度、對(duì)溫不如紫外檢測器敏度、對(duì)溫 度敏感、不能用于梯度洗脫測器寬。度敏感、不能用于梯度洗脫測器寬。 電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器 (electrochemical detector， ED) 包括電導(dǎo)、安培、庫侖、極譜和介電常數(shù)包括電導(dǎo)、安培、庫侖、極譜和介電常數(shù) 檢測器檢測器等。檢測器檢測器等。 1 、電導(dǎo)檢測器：、電導(dǎo)檢測器： 特點(diǎn)：特點(diǎn)：高靈敏度高靈敏度、高選

12、擇性高選擇性、結(jié)構(gòu)簡單結(jié)構(gòu)簡單、 操作成本低操作成本低、線性范圍寬（可達(dá)線性范圍寬（可達(dá)10106 6） 、死死 體積小體積小、選擇性、選擇性檢測器。檢測器。 是離子色譜中必是離子色譜中必 備的檢測器備的檢測器。 原理及結(jié)構(gòu)：原理及結(jié)構(gòu)：基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性， 利用離子在電場中遷移導(dǎo)電進(jìn)行檢測，其電導(dǎo)率與離 子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。 當(dāng)向電導(dǎo)池的兩個(gè)電極施加電 壓時(shí)，溶液中的陰離子向陽極移動(dòng)，陽離子向陰極移 動(dòng)。在電解質(zhì)溶液中的離子數(shù)目和離子的移動(dòng)速率決 定溶液的電阻大小，離子的遷移率或單位電場中離子 的速率取決于離子的電荷及其大小、介質(zhì)類型、溶液 溫度和離子濃度。離子的遷移速率取決于施

13、加電壓的 大小。所施加的電壓既可以是直流電壓，也可以是正 弦波或方波電壓。當(dāng)施加的有效電位確定后，即可測 量出電路中的電流值，即能測出電導(dǎo)值。 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 電導(dǎo)儀 電 極 電 極 液液 路路 電 極 電 源 局限：局限：對(duì)流速、溫度敏感、干擾比較多。對(duì)流速、溫度敏感、干擾比較多。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：高靈敏度、高選擇性、應(yīng)用很廣高靈敏度、高選擇性、應(yīng)用很廣 ，檢測具有氧化還原活性（能發(fā)生電極，檢測具有氧化還原活性（能發(fā)生電極 反應(yīng)）的物質(zhì)。反應(yīng)）的物質(zhì)。適于與反相色譜匹配。 2、安培檢測器：、安培檢測器： 原理：原理：當(dāng)被分離的電活性物質(zhì)流經(jīng)電極表面當(dāng)被分離的電活性物質(zhì)流經(jīng)電極表面 時(shí)，由于溶液與電

14、極間有電勢差，電活性物時(shí)，由于溶液與電極間有電勢差，電活性物 質(zhì)就要得到或失去電子，被還原或氧化，因質(zhì)就要得到或失去電子，被還原或氧化，因 此，溶液和電極間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，形成電流，此，溶液和電極間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，形成電流， 該電流符合法拉第定律，即該電流符合法拉第定律，即電流大小與待測電流大小與待測 物濃度成正比。物濃度成正比。記錄電流隨時(shí)間的變化，得記錄電流隨時(shí)間的變化，得 到電泳譜圖。到電泳譜圖。 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 接參比電極接參比電極 和對(duì)電極和對(duì)電極 接色譜柱接色譜柱 塑塑 料料 塊塊 工作電極工作電極 (Pt, Au, 碳糊碳糊) Teflon 1 cm 安培檢測器安培檢測器 局限：局限：

15、流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化 學(xué)隋性。只能檢測具有電活性的物質(zhì)。學(xué)隋性。只能檢測具有電活性的物質(zhì)。 極譜檢測器極譜檢測器 庫庫 侖侖 檢檢 測測 器器 極譜庫、侖檢測器結(jié)構(gòu)圖極譜庫、侖檢測器結(jié)構(gòu)圖 化學(xué)發(fā)光檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器 (Chemiluminescence detector， CD) 該檢測器是一種新型檢測器。該檢測器是一種新型檢測器。 1、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：快速、靈敏的新型檢測，最快速、靈敏的新型檢測，最 小檢出量可達(dá)小檢出量可達(dá)10-12g/ml, 設(shè)備簡單、價(jià)廉、設(shè)備簡單、價(jià)廉、 線性范圍寬等。線性范圍寬等。 2、原理與結(jié)構(gòu)：、原理與結(jié)構(gòu)：某些物質(zhì)在常溫下

16、進(jìn)行某些物質(zhì)在常溫下進(jìn)行 化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢反應(yīng)中間體化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢反應(yīng)中間體 或反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，或反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)， 就發(fā)射出光子。物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來自就發(fā)射出光子。物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來自 化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)分離組分從色譜柱中洗脫出化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)分離組分從色譜柱中洗脫出 來后，立即與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光試劑混合，來后，立即與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光試劑混合， 引起化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，通過光電倍增管將光引起化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，通過光電倍增管將光 信號(hào)變成電信號(hào)，進(jìn)行檢測。其光強(qiáng)度與信號(hào)變成電信號(hào)，進(jìn)行檢測。其光強(qiáng)度與 該物質(zhì)的濃度成正比。該物質(zhì)的濃度成正比。 蒸發(fā)光散射

17、檢測器蒸發(fā)光散射檢測器 (EvaporativeLight-scatteringDetector , ELSD) 通用型檢測器。通用型檢測器。 1、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能 被檢測。敏度高，對(duì)溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定， 適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。能檢測不含發(fā)色 團(tuán)的化合物，如：碳水化合物、脂類、聚合物、 未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物(人參 皂苷、黃芪甲苷)，并在沒有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu) 參數(shù)未知的情況下檢測未知化合物 。 2、原理及結(jié)構(gòu)：、原理及結(jié)構(gòu)： HPLC柱 噴霧氣體 蒸發(fā)漂移管 激光光源 樣品液滴 光二極管檢測器 散射室 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 示差折光示差折光紫外

18、紫外熒光熒光電導(dǎo)電導(dǎo) 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍通用通用選擇性選擇性 高選擇高選擇 性性 選擇性選擇性 可否梯度淋洗可否梯度淋洗不可不可可可可可不可不可 線性范圍線性范圍104103104 最小檢測量最小檢測量10-6g10-9g10-12g10-9g 對(duì)溫度敏感度對(duì)溫度敏感度敏感敏感低低敏感敏感 溶劑使用情況溶劑使用情況無限制無限制受限制受限制受限制受限制受限制受限制 幾種檢測器特性比較 105 低低 檢測器檢測器 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 主要特點(diǎn)主要特點(diǎn) 紫外紫外-可見光可見光 有紫外吸收的物質(zhì)；有紫外吸收的物質(zhì)；80%的的 有機(jī)物有機(jī)物 都可以檢測都可以檢測 池體積可制作得很??；池體積可制作得很小；檢測后不破檢測后不破 壞樣品，可用于制備壞樣品，可用于制備 熒光熒光 自身發(fā)熒光的物質(zhì)或熒光衍自身發(fā)熒光的物質(zhì)或熒光衍 生