分子生物學(xué)講座課件

1、分子生物學(xué)講座課件 第二節(jié)第二節(jié) 基因工程載體基因工程載體 一、作為載體的條件：一、作為載體的條件： 分離的基因自身不能繁殖，需要載體攜分離的基因自身不能繁殖，需要載體攜 帶它們到合適的細(xì)胞中復(fù)制和表現(xiàn)功能。帶它們到合適的細(xì)胞中復(fù)制和表現(xiàn)功能。 對(duì)理想的基因工程載體一般至少有以下幾對(duì)理想的基因工程載體一般至少有以下幾 點(diǎn)要求。點(diǎn)要求。 分子生物學(xué)講座課件 能在宿主細(xì)胞中復(fù)制，而且最好要有較能在宿主細(xì)胞中復(fù)制，而且最好要有較 高的復(fù)制能力。高的復(fù)制能力。 容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高 越好。越好。 容易插入外來(lái)核酸片段，插入后不影響容易插入外來(lái)核酸片段，插

2、入后不影響 其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要 求載體上要有合適的酶切位點(diǎn)。求載體上要有合適的酶切位點(diǎn)。 容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)。容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)。 有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志。有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志。 分子生物學(xué)講座課件 二、載體的種類(lèi)二、載體的種類(lèi) 按照性質(zhì)分：按照性質(zhì)分： 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 病毒載體病毒載體 按照功能分：按照功能分： 克隆載體克隆載體 表達(dá)載體表達(dá)載體 穿梭載體穿梭載體 分子生物學(xué)講座課件 常用的載體有質(zhì)粒，噬菌體和病毒等。常用的載體有質(zhì)粒，噬菌體和病毒等。 一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)

3、菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的， 能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。 其特點(diǎn)如下：其特點(diǎn)如下： 是染色體外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形是染色體外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA （covalently closed circuar DNA,cccDNA），可），可 自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300 kb 之間，之間，15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，的小質(zhì)粒比較容易分離純化， 15kb的大質(zhì)粒則不易提取。的大質(zhì)粒則不易提取。 分子生物學(xué)講座課件 能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。按質(zhì)能自主復(fù)制，是能

4、獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。按質(zhì) 粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類(lèi)：粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類(lèi)： v嚴(yán)緊控制（嚴(yán)緊控制（stringent control）型：復(fù)制常與）型：復(fù)制常與 宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞只有宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞只有 一個(gè)到十幾個(gè)拷貝；一個(gè)到十幾個(gè)拷貝； v松弛控制（松弛控制（relaxed control）型：復(fù)制和宿主）型：復(fù)制和宿主 不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。 分子生物學(xué)講座課件 質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。 這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀

5、雙也是環(huán)狀雙 鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功 能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部 分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生 存所必需的，也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒存所必需的，也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒 攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下 生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥 性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉 素、氨芐表霉

6、素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱(chēng)為抗素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱(chēng)為抗 藥性質(zhì)粒，又稱(chēng)藥性質(zhì)粒，又稱(chēng)R質(zhì)粒，帶有質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就質(zhì)粒的細(xì)菌就 能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖 。 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 二、噬菌體載體二、噬菌體載體 1、結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu) 噬菌體（噬菌體（phage）是感染細(xì)菌的一類(lèi)病毒，）是感染細(xì)菌的一類(lèi)病毒， 有的噬菌體基因組較大，例入有的噬菌體基因組較大，例入噬菌和噬菌和T噬噬 菌體等；有的則較小，如菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬噬 菌體等。用感染大腸桿菌的菌體等。用感染大腸桿菌的

7、噬菌體改造噬菌體改造 成的載體應(yīng)用最為廣泛。成的載體應(yīng)用最為廣泛。 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 噬菌體由頭和尾構(gòu)成，噬菌體由頭和尾構(gòu)成，DNA裝在頭部蛋白質(zhì)裝在頭部蛋白質(zhì) 外殼的里面。其基因組長(zhǎng)外殼的里面。其基因組長(zhǎng)48502bp，為線性雙鏈，為線性雙鏈 DNA。 噬菌體感染時(shí)，通過(guò)尾管將基因組噬菌體感染時(shí)，通過(guò)尾管將基因組DNA注入注入 大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。DNA 進(jìn)入大腸桿菌后以其兩端進(jìn)入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補(bǔ)單鏈粘末的互補(bǔ)單鏈粘末 端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以?xún)煞N不同的方式繁殖端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以?xún)?/p>

8、種不同的方式繁殖 。 分子生物學(xué)講座課件 溶菌性方式（溶菌性方式（lytic pathway）：在營(yíng)養(yǎng)充足，條）：在營(yíng)養(yǎng)充足，條 件適合細(xì)菌繁殖時(shí)，利用宿主菌中的酶類(lèi)和原料，件適合細(xì)菌繁殖時(shí)，利用宿主菌中的酶類(lèi)和原料， DNA上基因可按調(diào)控的順序表達(dá)合成構(gòu)成噬菌體頭、上基因可按調(diào)控的順序表達(dá)合成構(gòu)成噬菌體頭、 尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，DNA經(jīng)多次復(fù)制合成經(jīng)多次復(fù)制合成 許多子代許多子代DNA，于是裝配成許多子代的，于是裝配成許多子代的噬菌體，最噬菌體，最 后裂菌，釋放出許多新的后裂菌，釋放出許多新的噬菌體。噬菌體。 溶原性方式（溶原性方式（lysogenic pat

9、hway）：進(jìn)入細(xì)菌的）：進(jìn)入細(xì)菌的 DNA可整合可整合(integrate）入細(xì)菌的染色質(zhì)）入細(xì)菌的染色質(zhì)DNA中，隨中，隨 細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNA復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個(gè)穩(wěn)定潛復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個(gè)穩(wěn)定潛 伏在細(xì)菌染色質(zhì)伏在細(xì)菌染色質(zhì)DNA中的中的DNA稱(chēng)為原噬菌體稱(chēng)為原噬菌體 (prophage)，含有原噬菌體的細(xì)菌稱(chēng)為溶源菌，含有原噬菌體的細(xì)菌稱(chēng)為溶源菌 (lysogen)。DNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿的整合是可逆的，原噬菌體可從宿 主主DNA中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 2、基因組、基因組 噬菌體整

10、個(gè)基因組可分為三個(gè)部分：噬菌體整個(gè)基因組可分為三個(gè)部分： 左臂：長(zhǎng)約左臂：長(zhǎng)約20kb，編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)，編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì) 組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。 中段：長(zhǎng)約中段：長(zhǎng)約20kb，是，是DNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)整合和切出，溶原生長(zhǎng) 所需的序列。所需的序列。 右臂：長(zhǎng)約右臂：長(zhǎng)約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生 長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及DNA復(fù)制起始均復(fù)制起始均 在這區(qū)域內(nèi)。在這區(qū)域內(nèi)。 左右臂是必需的，中段是非必需的左右臂是必需的，中段是非必需的 。在中段插入外。在中段

11、插入外 源基因不影響它的增殖，這是作為載體的基礎(chǔ)。源基因不影響它的增殖，這是作為載體的基礎(chǔ)。 分子生物學(xué)講座課件 3、應(yīng)用、應(yīng)用 作為載體，但天然不行，需要改造作為載體，但天然不行，需要改造 分子生物學(xué)講座課件 一般地，基因工程操作可以分為四個(gè)步驟一般地，基因工程操作可以分為四個(gè)步驟 目的基因的獲得目的基因的獲得 目的基因和載體連接目的基因和載體連接 目的基因的轉(zhuǎn)化目的基因的轉(zhuǎn)化 目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá) 第三節(jié)第三節(jié) 目的基因的獲取目的基因的獲取 分子生物學(xué)講座課件 1、目的基因的概念、目的基因的概念 符合人們要求的符合人們要求的DNA片段，被稱(chēng)為目的基因。片段，被稱(chēng)為目的基因。 篩選文

12、庫(kù)篩選文庫(kù) PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 化學(xué)合成化學(xué)合成 2、得到目的基因的主要方法、得到目的基因的主要方法 分子生物學(xué)講座課件 （1）基因組）基因組DNA文庫(kù)文庫(kù) 從細(xì)胞中提取出全部從細(xì)胞中提取出全部DNA，用物理方法（超聲波，用物理方法（超聲波 等）或酶法（內(nèi)切酶不完全酶解）將等）或酶法（內(nèi)切酶不完全酶解）將DNA降解成降解成 大小不等的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體大小不等的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體 連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含 有一個(gè)基因組有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組片段與載體連接的重組DNA分分 子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許

13、多細(xì)胞一起組成一個(gè)子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè) 含有基因組各含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱(chēng)為基片段克隆的集合體，就稱(chēng)為基 因組因組DNA文庫(kù)（文庫(kù)（genomic DNA library）。如果這）。如果這 個(gè)文庫(kù)足夠大，能包含該生物基因組個(gè)文庫(kù)足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的全部的 序列，就是該生物完整的基因組文庫(kù)，能從這文序列，就是該生物完整的基因組文庫(kù)，能從這文 庫(kù)中釣取該生物的全部基因或庫(kù)中釣取該生物的全部基因或DNA序列。序列。 分子生物學(xué)講座課件 基因組基因組DNA酶切酶切 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 （2）cDNA文庫(kù)文庫(kù) 提出細(xì)胞的全部

14、提出細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成，在體外反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體），與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體） 連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA， 并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信信 息的息的cDNA克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的cDNA文文 庫(kù)。基因組含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只庫(kù)?；蚪M含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只 有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同 分化時(shí)期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類(lèi)和強(qiáng)度也不分化時(shí)期的細(xì)胞

15、其基因表達(dá)的種類(lèi)和強(qiáng)度也不 盡相同，所以盡相同，所以cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。 分子生物學(xué)講座課件 cDNA文庫(kù)顯然比基因組文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，文庫(kù)小得多， 能夠比較容易從中篩選克隆得細(xì)胞特異表達(dá)能夠比較容易從中篩選克隆得細(xì)胞特異表達(dá) 的基因。但對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從基因組的基因。但對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從基因組DNA 文庫(kù)獲得的基因與從文庫(kù)獲得的基因與從cDNA文庫(kù)獲得的不同，文庫(kù)獲得的不同， 基因組基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有含子和外顯子文庫(kù)所含的是帶有含子和外顯子 的基因組基因，而從的基因組基因，而從cDNA文庫(kù)中獲得的是已文庫(kù)中獲得的是已 經(jīng)過(guò)剪接、去

16、除了內(nèi)含子的經(jīng)過(guò)剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。 分子生物學(xué)講座課件 （3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地 用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR），從基因組），從基因組DNA或或cDNA中獲得目的基因，中獲得目的基因， 可不必要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的可不必要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的DNA文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程。 PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括：反應(yīng)系統(tǒng)包括： 含有目的基因的含有目的基因的DNA模板模板 對(duì)熱穩(wěn)定的對(duì)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶 一對(duì)寡核苷酸引物一對(duì)寡核苷酸引物 4

17、種三磷酸脫氧核苷種三磷酸脫氧核苷 保證聚合酶催化反應(yīng)的緩沖液保證聚合酶催化反應(yīng)的緩沖液 分子生物學(xué)講座課件 （4）人工化學(xué)合成）人工化學(xué)合成 現(xiàn)在計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)核酸合成儀已被廣泛現(xiàn)在計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)核酸合成儀已被廣泛 應(yīng)用，按人們?cè)O(shè)計(jì)好的序列一次合成應(yīng)用，按人們?cè)O(shè)計(jì)好的序列一次合成100- 200bp長(zhǎng)的長(zhǎng)的DNA片段已不成問(wèn)題。但隨意合成片段已不成問(wèn)題。但隨意合成 的的DNA絕大多數(shù)肯定不具有生物功能或無(wú)法知絕大多數(shù)肯定不具有生物功能或無(wú)法知 道它會(huì)有什么功能的，因而只能模仿自然界生道它會(huì)有什么功能的，因而只能模仿自然界生 物中已知的基因序列來(lái)合成，而化學(xué)合成這樣物中已知的基因序列來(lái)合

18、成，而化學(xué)合成這樣 長(zhǎng)的基因長(zhǎng)的基因DNA序列，其價(jià)格遠(yuǎn)高于用序列，其價(jià)格遠(yuǎn)高于用PCR法法 獲得基因，所以目前很少全部用化學(xué)方法去合獲得基因，所以目前很少全部用化學(xué)方法去合 成基因。但人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成核酸片段作為引成基因。但人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成核酸片段作為引 物、接頭等已經(jīng)成為分子生物學(xué)和基因工程中物、接頭等已經(jīng)成為分子生物學(xué)和基因工程中 必不可少而且十分重要的手段必不可少而且十分重要的手段。 分子生物學(xué)講座課件 第四節(jié)第四節(jié) 目的基因和載體的連接目的基因和載體的連接 將目的基因或序列插入載體，主要靠將目的基因或序列插入載體，主要靠DNA連連 接酶。有以下主要的方式。接酶。有以下主要的方式。 一

19、、粘性末端連接一、粘性末端連接 如果目的序列兩端有與載體上相同的限制性核如果目的序列兩端有與載體上相同的限制性核 酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，則同一限制酶切開(kāi)產(chǎn)生的粘末端，酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，則同一限制酶切開(kāi)產(chǎn)生的粘末端， 在降低溫度退火時(shí)，能重新互補(bǔ)結(jié)合，在在降低溫度退火時(shí)，能重新互補(bǔ)結(jié)合，在DNA 連接酶催化下，目的序列就與載體連接酶催化下，目的序列就與載體DNA鏈相連鏈相連 接。接。 分子生物學(xué)講座課件 分子生物學(xué)講座課件 不同的限制性?xún)?nèi)切酶切，如果產(chǎn)生的不同的限制性?xún)?nèi)切酶切，如果產(chǎn)生的DNA的粘的粘 末端相同（同尾酶），也可用此法連接。末端相同（同尾酶），也可用此法連接。 如果在連接的兩個(gè)如果在連接的兩個(gè)

20、DNA片段沒(méi)有能互補(bǔ)的粘性片段沒(méi)有能互補(bǔ)的粘性 末端，可用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氧單核苷酸末端，可用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氧單核苷酸 添加添加DNA的的3末端，例如一股末端，例如一股DNA3端加上端加上polyG， 另一股另一股DNA3端加上端加上polyC，人工在，人工在DNA兩端做出兩端做出 能互補(bǔ)的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能連接，能互補(bǔ)的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能連接， 稱(chēng)為同聚物加尾法。稱(chēng)為同聚物加尾法。 對(duì)平末端的對(duì)平末端的DNA，可先連上人工設(shè)計(jì)合成的脫，可先連上人工設(shè)計(jì)合成的脫 氧寡核苷酸雙鏈接頭，使氧寡核苷酸雙鏈接頭，使DNA末端產(chǎn)生新的限制末端產(chǎn)生新的限制 內(nèi)切酶位點(diǎn)

21、，經(jīng)內(nèi)切酶割后，即可按粘性末端相內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)內(nèi)切酶割后，即可按粘性末端相 連。連。 分子生物學(xué)講座課件 GGGGG CCCCC 5 53 3 同聚物加尾法同聚物加尾法 分子生物學(xué)講座課件 二、平末端連接二、平末端連接 T4 DNA連接酶能催化連接酶能催化DNA平末端的連平末端的連 接。如果目的序列和載體上沒(méi)有相同的接。如果目的序列和載體上沒(méi)有相同的 限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)可供利用，用不同的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)可供利用，用不同的 限制性?xún)?nèi)切酶切割后的粘性末端不能互限制性?xún)?nèi)切酶切割后的粘性末端不能互 補(bǔ)結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇⒀a(bǔ)結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇NA突出的突出的 末端削平或補(bǔ)齊成平末端，再用末端削平或

22、補(bǔ)齊成平末端，再用T4 DNA 連接酶連接，但平末端連接要比粘性末連接酶連接，但平末端連接要比粘性末 端連接的效率低得多。端連接的效率低得多。 分子生物學(xué)講座課件 第五節(jié)第五節(jié) 目的基因?qū)爰?xì)胞目的基因?qū)爰?xì)胞 目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì) 胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過(guò)篩選，才能胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過(guò)篩選，才能 獲得重組獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在分子克隆，不同的載體在 不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方 法也不相同。法也不相同。 一、原核細(xì)胞一、原核細(xì)胞 分子生物學(xué)講座課件 1、熱激和電激、熱激和電激 由于外源由

23、于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳特性改變稱(chēng)的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳特性改變稱(chēng) 為轉(zhuǎn)化。為轉(zhuǎn)化。1943年年Avery等就發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化等就發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化 現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 DNA自然進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在基因工程中自然進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在基因工程中 可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容 易接受外界易接受外界DNA，稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源，稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源 DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌 經(jīng)冰冷經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加 入重組質(zhì)粒并突然由入重

24、組質(zhì)粒并突然由4轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入42作短時(shí)間處理，作短時(shí)間處理， 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作 用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱(chēng)為電穿孔用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱(chēng)為電穿孔 轉(zhuǎn)化法。轉(zhuǎn)化法。 分子生物學(xué)講座課件 2、感染、感染 噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖 就是感染（就是感染（infection）。用經(jīng)人工改造的噬菌體）。用經(jīng)人工改造的噬菌體 活病毒作載體，以其活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在與目的序列重組后，在 體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將

25、重組DNA包裝包裝 成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn) 入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。 3、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染 重組的噬菌體重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入的方式進(jìn)入 宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過(guò)宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過(guò)CaCl2，電穿孔等處理，電穿孔等處理 成感受態(tài)細(xì)菌再接受成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬 菌體菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱(chēng)為轉(zhuǎn)可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱(chēng)為轉(zhuǎn) 染。染。 分子生物學(xué)講座課件 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍

26、法基因槍法 其他方法其他方法 二、真核細(xì)胞二、真核細(xì)胞 分子生物學(xué)講座課件 根癌農(nóng)桿菌（根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） 發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌(A. rhizogenes) 1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 分子生物學(xué)講座課件 根癌農(nóng)桿菌浸染根癌農(nóng)桿菌浸染 分子生物學(xué)講座課件 發(fā)根農(nóng)桿菌浸染發(fā)根農(nóng)桿菌浸染 分子生物學(xué)講座課件 1974年年Zaenen等研究發(fā)現(xiàn)，根癌農(nóng)桿菌中存在一個(gè)等研究發(fā)現(xiàn)，根癌農(nóng)桿菌中存在一個(gè) 或幾個(gè)大的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生腫瘤所或幾個(gè)大的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生腫瘤所 必須的，并稱(chēng)之為必須的，并稱(chēng)之為T(mén)i質(zhì)粒（質(zhì)粒（tumour in

27、ducing plasmid）。根癌農(nóng)桿菌的）。根癌農(nóng)桿菌的Ti為質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌的為質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌的 為為Ri質(zhì)粒。質(zhì)粒。1977年，用限制性?xún)?nèi)切酶的方法證實(shí)植年，用限制性?xún)?nèi)切酶的方法證實(shí)植 物腫瘤組織中存在一段外來(lái)的物腫瘤組織中存在一段外來(lái)的DNA，是整合進(jìn)植物，是整合進(jìn)植物 染色體的根癌農(nóng)桿菌染色體的根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的一個(gè)片段，稱(chēng)為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的一個(gè)片段，稱(chēng)為轉(zhuǎn)移 DNA（transferred DNA），簡(jiǎn)稱(chēng)），簡(jiǎn)稱(chēng)T-DNA。當(dāng)植物。當(dāng)植物 受傷時(shí)受傷時(shí)T-DNA會(huì)轉(zhuǎn)入并整合到植物的基因組中，然會(huì)轉(zhuǎn)入并整合到植物的基因組中，然 后借助植物的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)后借助植物的轉(zhuǎn)錄和翻譯

28、系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基本方法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基本方法 分子生物學(xué)講座課件 農(nóng)桿菌示意圖農(nóng)桿菌示意圖 分子生物學(xué)講座課件 T-DNA 右邊界 左邊界 Vir 區(qū) Ti plasmid 目的基因 分子生物學(xué)講座課件 細(xì)胞核，示核細(xì)胞核，示核 仁和核孔仁和核孔 農(nóng)桿菌附著農(nóng)桿菌附著 在細(xì)胞壁上在細(xì)胞壁上 分子生物學(xué)講座課件 T-DNA轉(zhuǎn)移的過(guò)程示意圖轉(zhuǎn)移的過(guò)程示意圖 分子生物學(xué)講座課件 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 單拷貝單拷貝 插入片段大插入片段大 表達(dá)高效表達(dá)高效 不需要貴重儀器不需要貴重儀器 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化特點(diǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化特點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 基因型依賴(lài)基因型依賴(lài) 愈傷組織褐化壞死愈傷組織褐化壞死 單子葉不敏感單

29、子葉不敏感 抑菌比較困難抑菌比較困難 分子生物學(xué)講座課件 PDS 1000/He 2 2、基因槍法、基因槍法 分子生物學(xué)講座課件 基因槍原理基因槍原理 分子生物學(xué)講座課件 手持式基因槍手持式基因槍 分子生物學(xué)講座課件 基因槍轉(zhuǎn)化特點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單 快速高效快速高效 處理樣品多處理樣品多 不依賴(lài)基因型不依賴(lài)基因型 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 費(fèi)用高費(fèi)用高 基因沉默基因沉默 多拷貝多拷貝 分子生物學(xué)講座課件 3 3、其他方法、其他方法 花粉管通道法花粉管通道法 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 超聲波法、超聲波法、 電激法、電激法、 激光轉(zhuǎn)化法等激光轉(zhuǎn)化法等 分子生物學(xué)講座課件 第六節(jié)第六節(jié) 含目的基因克隆的篩選與鑒定含目的基因克隆的篩選與鑒定 目的序列與載體目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導(dǎo)正確連接的效率、重組導(dǎo) 入細(xì)胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長(zhǎng)入細(xì)胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長(zhǎng) 繁殖出來(lái)的細(xì)胞并不同都帶有目的序列。一般一繁殖出來(lái)的細(xì)胞并不同都帶有目的序列。一般一 個(gè)載體只攜帶某一