Western-blot實驗操作步驟

1、一、制備蛋白樣品（單層貼壁細胞總蛋白提?。? 倒掉細胞培養(yǎng)液，加3ml預(yù)冷的PBS洗滌細胞，重復(fù)兩次，棄掉PBS 后將細胞培養(yǎng)瓶置于冰上。2裂解液RIPA （強）1ml +PMSF10UI （100:1）,兩者混勻后加入培養(yǎng)瓶中裂解細胞，冰上裂解30min,為使細胞充分裂解，培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。3. 裂解完后，用細胞刮將細胞刮于一側(cè)（動作要快），轉(zhuǎn)移至ep管中.4.4度，12000rpm,離心5min.離心后取上清至新的ep管中，用于后 續(xù)實 驗（-80保存）常用蛋白收樣：倒掉細胞培養(yǎng)基后，預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，棄去，再 加入1 ml PBS用細胞刮輕輕刮取細胞，轉(zhuǎn)移至1.5ml ep管中

2、， 12000rpm,離心5min，盡量吸凈上清，沉淀于-80保存，用于后續(xù)實驗。融化蛋白樣品，加入RIPA+PMS細胞裂解液（200ul/ep管），充分混 勻，冰上裂解20min, 4度離心，5min , 12000rpm,小心吸取上清至新 的ep管中。二、蛋白濃度測定（BCA法）BCA碧云天）蛋白濃度測定試劑盒靈敏度高，檢測濃度下限達到25ug/ml，最小檢測蛋白量達到0.5ug，待測樣品體積為1-20ul。在50- 2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性矢系。標準蛋白BSA濃度：5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白標準品，取10ul稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml (

3、ug/ul)。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡便起見，也可以用0.9%NaC或PBSA釋標準品。1. 配置BCA工作液A液：B液二50 : 1 ，混勻A液+B液=200ul （每個樣本）樣本數(shù)量：7個標準品+ N個待測蛋白樣本2. 先將每孔加入200ul BCAT作液，再加入蛋白樣本。（96孔板）總體積為10uL待測蛋白樣本先10倍稀釋96孔編號#1#2#3#4#5#6#7BSA標準Oul1ul2ul4ul6ul8ul10ul蛋白ddH2O10ul9ul8ul6ul4ul2ulOul96孔待測蛋 白樣本1待測蛋 白樣本2待測蛋 白樣本 3待測蛋 白樣本N10ul/ we

4、ll3.37度，溫箱中孵育30min。562nm波長，測ODf直。待測蛋白樣品濃 度在50-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性尖系。4. 根據(jù)所測樣品的0D直，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線即可計算樣本 相應(yīng)的蛋白含量，除以樣本稀釋液總體積（10ul）,再乘以樣本稀釋倍 數(shù)，即為樣本的實際濃度（ug/ul）5. 蛋白定量后，以最小蛋白濃度為標準，將各組蛋白樣本調(diào)至相同濃度（ddH2O補齊）繪制標準曲線：X軸為蛋白質(zhì)量，丫為0D直插入一 XY散點圖，選中圖上一點，右鍵，添加趨勢線一選項（顯示公式，顯示R2，R20.99有意義）三、蛋白變性1 室溫融解SDS-PAG蛋白上樣緩沖液（漠酚藍染料）（

5、2x或5x ）2 將適量蛋白樣本與SDS-PAG上樣緩沖液混合，使其終濃度為1x3.100 度或沸水煮3-5min，充分變性蛋白。冷卻至室溫后，直接上樣到SDS- PAG膠加樣孔內(nèi)即可?；蚶鋮s后-80保存用于后續(xù)實驗。四、蛋白電泳1 -配膠：根據(jù)配膠試劑盒操作步驟，按照目的蛋白分子量大小，選擇 相應(yīng)濃度的分離膠。配膠時最后加10%士硫酸鞍和TEMED每板分離膠 5ml，濃縮膠3ml.短板在內(nèi)側(cè)。配好后如暫時不用，可將膠板取下，電 泳液中浸泡，4度保存。2. 配電泳液1x甘氨酸-Tris電泳緩沖液1LTris 3.03g甘氨酸14.4gSDS 1g3. 蛋白上樣：樣本10-30ul （保證蛋白質(zhì)

6、量最少為30ug） 20-25ul蛋白 Marker 5ul選擇較好的孔加樣，并記錄加樣位置4. 連接電極，跑電泳:電泳條件80V,30min （藍色條帶到達濃縮膠底 部）-1 1 0V,90min （參考Marker的位置藍色條帶跑到膠底部即可）五、轉(zhuǎn)膜1 配轉(zhuǎn)膜液:1L Tris 3.03g甘氨酸I4.4g,加水至800ml,最后加甲醇200ml,調(diào)至總體積為1L.2. 切膠：起膠時將膠留在長玻璃板上，將裁減好的膜做好標記后浸泡在 轉(zhuǎn)膜液中。確定目的蛋白的位置（根據(jù)Marker條帶），切膠，保 留目的 蛋白位置,將膜置于膠上，膜數(shù)字面在上,背面與膠相貼，數(shù)字標記端貼在 Marker 上。3. 準備轉(zhuǎn)膜：按如下順序陽極（紅）濾纟氏膜膠濾紙陰極（黑）4. 連接電極，轉(zhuǎn)膜：90V,90min六、封閉1 配封閉液:0.5g脫脂奶粉+ 10ml PBS2取下膜，注意蛋白在膜與膠貼合的一面，取下后將膜有蛋白面朝下，封 閉1小時七、抗體孵育配抗體稀釋液：0.5g脫脂奶粉，10ul Tween, 10ml PBS配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育，4度過夜次日，洗膜液洗