果蠅精子形成過(guò)程中基因調(diào)控的分子機(jī)制

1、果蠅精子形成過(guò)程中基因調(diào)控的分子機(jī)制果蠅精子形成過(guò)程中基因調(diào)控的分子機(jī)制海倫.白-庫(kù)伯卡迪夫大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 博物館大街 CF10 3AX，UK通訊作者 海倫.白-庫(kù)伯 電子郵件地址：white-coopercf.ac.uk摘要：從形態(tài)上普通的細(xì)胞分化成為高度專一、能夠獨(dú)立生活、具有活力的細(xì)胞，精子細(xì)胞的分化需要大量基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)作用。這類產(chǎn)物的表達(dá)必須是在發(fā)育環(huán)境下進(jìn)行調(diào)控，以確保正常的細(xì)胞分化。精子形成過(guò)程中的許多必要基因在動(dòng)物體內(nèi)是不發(fā)揮作用的，也許在其它地方表達(dá)，但使用不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模板。因此，精子的形成過(guò)程是一個(gè)非常好的闡明組織特異性基因表達(dá)原理的系統(tǒng)。同樣，對(duì)于它本身的正確性也變

2、得有趣起來(lái)。在這里，我討論了果蠅精子形成過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控，重點(diǎn)論述了雄性生殖細(xì)胞系中睪丸特異性基因的表達(dá)過(guò)程。 果蠅睪丸的解剖學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)結(jié)構(gòu) 果蠅的睪丸是由肌肉和色素細(xì)胞組成的具有盲端的管狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，管中充滿了雄性生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞。詳見Fuller在1993年對(duì)果蠅精子形成的詳細(xì)描述。在管的一端有一個(gè)厚的基底層區(qū)域，覆蓋著由20個(gè)有絲分裂后hub細(xì)胞構(gòu)成的小集群，它們構(gòu)成了一個(gè)維護(hù)正常干細(xì)胞的信號(hào)中心。分布在hub細(xì)胞周圍的是兩種干細(xì)胞群，生殖細(xì)胞系細(xì)胞的每一次減數(shù)分裂都會(huì)再產(chǎn)生一個(gè)生殖細(xì)胞系細(xì)胞，并且還產(chǎn)生一個(gè)精原細(xì)胞。（體細(xì)胞）囊狀祖細(xì)胞的每一次減數(shù)分裂都會(huì)再產(chǎn)生一個(gè)囊狀祖細(xì)胞

3、，并且還產(chǎn)生一個(gè)囊狀細(xì)胞。盡管囊狀祖細(xì)胞的分裂同樣也會(huì)產(chǎn)生新的hub細(xì)胞。兩種囊細(xì)胞都包裹住精原細(xì)胞，并形成了囊狀結(jié)構(gòu)，并且與哺乳動(dòng)物睪丸中的支持細(xì)胞有相似的功能?，F(xiàn)在，這些囊狀細(xì)胞處于后有絲分裂期，與此同時(shí)，這些囊狀精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)4次有絲分裂形成16個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞。就像哺乳動(dòng)物精子的形成一樣，形成精子的分裂也是以不完全胞質(zhì)分裂、姐妹細(xì)胞間以穩(wěn)定的胞質(zhì)橋梁相連接為特征。初級(jí)精母細(xì)胞迅速通過(guò)減數(shù)分裂前s期并進(jìn)入持續(xù)超過(guò)3天的細(xì)胞循環(huán)G2期，在此期間，細(xì)胞體積明顯增大，經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂形成的64個(gè)圓的精子細(xì)胞仍然包在一個(gè)囊中。并且相互協(xié)調(diào)聯(lián)系產(chǎn)生極化，所以，這個(gè)囊狀結(jié)構(gòu)本身就是不對(duì)稱的。在精子細(xì)胞的

4、伸長(zhǎng)階段，兩種囊細(xì)胞的不同之處變得明顯起來(lái)。頭部的囊細(xì)胞覆蓋在精子細(xì)胞的尾部，而尾部的囊細(xì)胞壓縮正在伸長(zhǎng)的尾部。囊細(xì)胞調(diào)整精子的頭部朝向睪丸的底部，而尾部則朝向睪丸的頂端伸長(zhǎng)。最后，充分伸長(zhǎng)的精子細(xì)胞再進(jìn)行個(gè)體化發(fā)育，在此期間，將擠出多余的細(xì)胞質(zhì)，個(gè)體發(fā)育完的精子細(xì)胞在睪丸的底部呈圓圈狀，直到被排入精囊中。果蠅睪丸中的基因表達(dá)原始的增值中心 在睪丸的頂端區(qū)域含有hub細(xì)胞，干細(xì)胞（生殖細(xì)胞系細(xì)胞和囊祖細(xì)胞）以及有絲分裂精原細(xì)胞囊，它們共同構(gòu)成了原始的生發(fā)中心。在這里，基因的特異性表達(dá)似乎涉及到干細(xì)胞的行為調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)干細(xì)胞發(fā)育成與hub基因相關(guān)的細(xì)胞，并且促進(jìn)從hub中移走的細(xì)胞的分化。幾種

5、信號(hào)通路解釋了這一過(guò)程。包括所有種類干細(xì)胞的中JAK-STAT信號(hào)的激活，并與hub的配體進(jìn)行反應(yīng)，以及生殖系細(xì)胞的和精原細(xì)胞的中DPP通路的激活。最近，這幾種通路在其它領(lǐng)域也受到了重視。有這些信號(hào)事件決定靶細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄改變的研究已經(jīng)取得了進(jìn)展。通過(guò)擴(kuò)配的生殖系干細(xì)胞和擴(kuò)配的精原細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)，在hub或干細(xì)胞中的特異性表達(dá)上存在很少的相關(guān)基因。但是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在干細(xì)胞JKA-STAT信號(hào)通路潛在靶基因。一個(gè)把基因、鋅指同源-1以及轉(zhuǎn)錄因子是必須且足以囊祖細(xì)胞的，通過(guò)抑制與囊祖細(xì)胞分化的相關(guān)基因的表達(dá)，有趣的是，囊細(xì)胞中的鋅指同源-1的持續(xù)表達(dá)阻止了囊干細(xì)胞自身的表達(dá)以及生殖系細(xì)胞的非自主關(guān)閉

6、的分化。這表明，睪丸頂點(diǎn)區(qū)域的信號(hào)發(fā)生要比之前我們想的要復(fù)雜得多，并且，我們對(duì)兩種干細(xì)胞的行為上的協(xié)調(diào)作用的機(jī)制還不清楚。初級(jí)精母細(xì)胞的激活一個(gè)特異的轉(zhuǎn)錄程序?qū)τ谛坌陨诚导?xì)胞來(lái)說(shuō)，有絲分裂的完成以及進(jìn)入精母細(xì)胞階段標(biāo)志著一個(gè)戲劇性的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。我不知道在動(dòng)物的雄性生殖系干細(xì)胞和囊細(xì)胞中表示的任何一種基因是否在其它細(xì)胞中也表達(dá)，睪丸特異性基因的表達(dá)在精母細(xì)胞中被激活。20世紀(jì)60年代和70年代進(jìn)行的將3H-尿苷整合到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)表明，在哺乳動(dòng)物的精子中存在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄。相似的關(guān)于果蠅的影像研究表明，在成熟的初級(jí)精母細(xì)胞階段開始將3H-尿苷整合到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中沒(méi)有協(xié)調(diào)作用。因此，盡管減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄被

7、認(rèn)為普遍存在于哺乳動(dòng)物圓形的精子細(xì)胞中，但直到最近它才被認(rèn)為在果蠅的精子形成過(guò)程中不存在。這表明，在精子形成過(guò)程中所需要的蛋白質(zhì)都是在初級(jí)精母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄形成的，并且一直都被儲(chǔ)存著，直到被需要利用。這包括，例如精子尾部的蛋白質(zhì)Donjuan以及許多其它的蛋白質(zhì)都是在初級(jí)精母細(xì)胞核中合成的，并且都保持著翻譯抑制狀態(tài)并持續(xù)幾天，直到精子形成的后期階段。脊椎動(dòng)物中也是如此，盡管也存在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄，但都被染色質(zhì)的濃縮所抑制，并且在精子形成的后期需要依賴于儲(chǔ)存mRNA的翻譯。初級(jí)精母細(xì)胞中的基因表達(dá) 對(duì)成體的不同基因芯片分析表明，基因組織中大約50%的基因在睪丸中表達(dá)，并且在成體中檢測(cè)到的8%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

8、是睪丸特異性的，而且還有5%是在睪丸中擴(kuò)增的。因此，與其它組織相比，睪丸中表達(dá)的全部基因中的25%是睪丸特異性的或者是在睪丸中擴(kuò)增的，相似的研究表明，這些基因在睪丸中表達(dá)，但不是編碼蛋白質(zhì)的作用。精子中的全部蛋白質(zhì)被證實(shí)是由350種蛋白質(zhì)組成的，這些蛋白質(zhì)中的50%是睪丸中富含的或者是特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。令人欣慰的是，已知的精子特異性蛋白，例如B2-微管蛋白和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白都在數(shù)據(jù)庫(kù)中可以查到。睪丸特異性或是睪丸中擴(kuò)增的基因大體上要分為兩類，一類是在其它組織（有時(shí)是睪丸）中表達(dá)的含有明顯的共源產(chǎn)物，另一類則是不含有共源產(chǎn)物。表1列出了這兩類基因的基因片段，表明了何種基因在果蠅的初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)。這

9、個(gè)列表中顯示出了多種不同基因本質(zhì)上的分類，包括，代謝、胞質(zhì)骨架以及染色質(zhì)的組織等。然而或許是依據(jù)基因本質(zhì)上進(jìn)行的睪丸特異性基因和睪丸蛋白質(zhì)分類所得出的結(jié)論就是，最大的一類是“無(wú)功能預(yù)測(cè)”在果蠅基因組中，僅限于睪丸特異性精子蛋白組基因本質(zhì)上的分析是特別引人注意的。這些基因中得很小一部分有功能預(yù)測(cè)，甚至在這些已經(jīng)進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)基因中很少進(jìn)行過(guò)檢測(cè)，大多數(shù)基因的功能是不明確的。X染色體上基因的表達(dá) 已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在雄性中，對(duì)于基因發(fā)揮主要作用而言，X染色體不是一個(gè)非常好的地方，并且有一個(gè)X染色體的雄性偏置和睪丸偏置影響基因以外的一般模式。通過(guò)復(fù)制會(huì)產(chǎn)生一對(duì)基因，常染色體副本要比與X染色體相關(guān)的副

10、本更加具有睪丸偏置影響表達(dá)。潛在的進(jìn)化力量推動(dòng)了這些事件的進(jìn)行，包括性antogonism，因?yàn)樾坌允荴單倍體，所以與X相關(guān)的等位基因的復(fù)制要比雌性花更多的時(shí)間，因此，變異對(duì)雄性有利而對(duì)雌性不利就被相應(yīng)的選擇出來(lái)了。精子形成過(guò)程中X染色體的失活將會(huì)給與X相關(guān)的精子形成基因的相對(duì)基因更強(qiáng)的選擇作用。這兩種力量共同推進(jìn)了X染色體失活的假說(shuō)。同樣，在脊椎動(dòng)物精原細(xì)胞的減數(shù)分裂中X染色體也會(huì)失活。并且對(duì)于X染色體是在果蠅的初級(jí)精母細(xì)胞中失活的說(shuō)法在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)存在爭(zhēng)議。這個(gè)觀測(cè)結(jié)果對(duì)一大類的睪丸中豐富的基因和一小類體細(xì)胞中豐富的基因都是正確的的。通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成精子的381種蛋白質(zhì)中只有43種是由

11、X染色體編碼的，這再一次證明了存在于X染色體上的鏡子基因的不足性。有趣的是，盡管如此，仍有大量的與X染色體相關(guān)的基因是在睪丸中特異性表達(dá)或擴(kuò)增的。這表明，在這里確實(shí)有一些激活子發(fā)揮了作用。與全部的成體樣本相比，在睪丸中最豐富的50種基因中，13種存在于X染色體上。對(duì)于結(jié)構(gòu)基因，如sdic基因和與X染色體相關(guān)的筑絲蛋白基因家族的擴(kuò)大串聯(lián)而言，X染色體的確是一個(gè)好的地方。最近一個(gè)將轉(zhuǎn)基因插入X染色體與插入常染色體在表達(dá)上的比較分析表明，至少有一種睪丸特異激活子要比插入常染色體中更高效的發(fā)揮了功能，盡管這個(gè)表達(dá)作用是在與X染色體相關(guān)的插入中檢測(cè)的。這表明，在X染色體上存在著一個(gè)較低水平的表達(dá)，盡管對(duì)

12、其它激活子的大部分觀察結(jié)果還未進(jìn)行檢驗(yàn)。減數(shù)分裂阻滯位點(diǎn)：初級(jí)精母細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控盡管在精子細(xì)胞分化的過(guò)程中有多種細(xì)胞內(nèi)事件的協(xié)調(diào)作用，遺傳分析表明，大多的形態(tài)上的事件都是獨(dú)立調(diào)節(jié)的。例如，精子細(xì)胞的伸長(zhǎng)涉及到鞭毛軸絲的合成、線粒體融合以及線粒體衍生物的伸長(zhǎng)和質(zhì)膜的極性生長(zhǎng)等。突變的精子細(xì)胞fws中，保守的低聚高爾基體亞基，或是syntaxin5，它們都對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體物質(zhì)運(yùn)輸非常重要，它們可以啟動(dòng)軸絲和線粒體的伸長(zhǎng)等，但在這些男性體內(nèi)（xu et al.2002,Farkas et al.2003）細(xì)胞不能生長(zhǎng)，囊細(xì)胞也不能伸長(zhǎng).在精子突變體fzo中，絲裂融蛋白以及線粒體融合不能發(fā)生，

13、但精子細(xì)胞可以伸長(zhǎng)。令人驚訝的是，精子細(xì)胞的分化并不完全依賴于減數(shù)分裂的完成，細(xì)胞周期激活因子交織引起精子細(xì)胞的突變，使細(xì)胞不能發(fā)生減數(shù)分裂而是使精子細(xì)胞發(fā)生分化成為4N，16個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的囊狀過(guò)程。 盡管特別的形態(tài)事件發(fā)生具有獨(dú)立性，但遺傳學(xué)分析揭示了精子基因組程序是如何協(xié)調(diào)的。在精原細(xì)胞arrest發(fā)育過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一類“減數(shù)分裂阻滯”突變體，它們不能進(jìn)行減數(shù)分裂或精子細(xì)胞的發(fā)生。雄性突變體睪丸中的減數(shù)分裂阻滯位點(diǎn)僅僅包括精子形成過(guò)程中直到成熟初級(jí)精母細(xì)胞的各個(gè)階段。這些睪丸中的初級(jí)精母細(xì)胞，它們既不進(jìn)行減數(shù)分裂也不促進(jìn)精子細(xì)胞的分化，在發(fā)生減數(shù)分裂阻滯突變的睪丸的底部區(qū)域明顯含有退化的細(xì)胞

14、。這些睪丸與患有成熟減數(shù)分裂精子細(xì)胞缺乏癥病人的睪丸相似。減數(shù)分裂阻滯位點(diǎn)分為兩種不同的表型對(duì)第一次減數(shù)分裂突變體的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)檢測(cè)表明，can,mia,sa突變體中部分凝聚染色體的結(jié)構(gòu)與正常前期的結(jié)構(gòu)相似。相反的是，在aly基因突變的精母細(xì)胞中，染色體在形態(tài)上是非常分散的，并且染色體顯得非常模糊。為了弄明白減數(shù)分裂阻滯突變體是如何影響減數(shù)分裂和精子細(xì)胞分化的過(guò)程，我們檢測(cè)了幾種對(duì)這些過(guò)程十分重要的基因的表達(dá)情況。對(duì)初級(jí)精母細(xì)胞功能很重要的基因在突變的精母細(xì)胞中表達(dá)了，這表明，在初級(jí)精母細(xì)胞中，減數(shù)分裂阻滯基因不是轉(zhuǎn)錄的全部激活子。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)，精子形成過(guò)程中起重要作用的基因的mRNA

15、在can,mia,sa基因突變的初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)量很低，并且在aly基因突變的初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)不到。aly基因突變體在細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄方面與其它幾種突變體表現(xiàn)不同：aly基因突變體需要Twine基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但是can,mia和sa突變體需要的是轉(zhuǎn)錄后的Twine蛋白產(chǎn)物，因此，我們推斷，在初級(jí)精母細(xì)胞中，減數(shù)分裂阻滯基因?qū)D(zhuǎn)錄是很重要的，在精子形成過(guò)程中，主要的基因產(chǎn)物發(fā)揮作用。我們進(jìn)一步推斷，減數(shù)分裂阻滯基因又可細(xì)分為aly基因類和can基因類兩類，且這種分類在最近關(guān)于減數(shù)分裂阻滯位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)中應(yīng)用。aly類基因突變體影響睪丸中多于1000種基因的轉(zhuǎn)錄，然而can類基因突變體則有些局限于

16、靶基因。大約有150種基因可以在can類基因突變體中表達(dá)，而在aly基因類突變體中則不能。而且，aly類基因的無(wú)效突變體明顯的削弱了靶基因的表達(dá)，盡管靶基因的表達(dá)作用減弱了，但在發(fā)生can類基因突變的睪丸中可以檢測(cè)到它。aly類基因的產(chǎn)物形成了睪丸特異性TFD共源復(fù)合物多亞基轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物TFD是由TATA-結(jié)合蛋白和多達(dá)12個(gè)TATA-結(jié)合蛋白相關(guān)因子構(gòu)成的，它在促進(jìn)基因啟動(dòng)子區(qū)域與RNA核糖核苷酸聚合酶之間的相互作用方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。can基因的克隆表明，它編碼了與無(wú)處不表達(dá)的TAF,dTAFS物質(zhì)共源的睪丸特異性物質(zhì)。mia,sa,rye基因的克隆表明，它們也編碼組織特異性物質(zhì)TAF

17、s，這就產(chǎn)生了一個(gè)假說(shuō)，即存在一個(gè)無(wú)處不需要TAFs物質(zhì)的睪丸特異性區(qū)域。睪丸TFD物質(zhì)包含由can基因減數(shù)分裂阻滯位點(diǎn)編碼的TAFs，由TAF1和TAF2混雜而成。一個(gè)TAF1與同型的TAF1相連，并且在睪丸中大量擴(kuò)增。假設(shè)這個(gè)啟動(dòng)子與靶基因相互作用，則復(fù)合物中也會(huì)含有TBP（或幾種TBP相關(guān)蛋白的一種），盡管通常DNA連接活性是TBP賦予的，但也有可能由TAF1或2中的兩種AT-hook motifs所提供的。盡管睪丸TFD復(fù)合物的postulated與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)相一致，但值得注意的是，TAFs不僅是TFD的組成成分，而且還與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和PCG復(fù)合物相關(guān)，這使得功能預(yù)測(cè)變得更加困難。

18、tTAFs的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致產(chǎn)生了一個(gè)功能模型，其中它們僅僅是替代了通常表達(dá)的TFD復(fù)合物，并且具有轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，特別是作為精子形成基因的激活子。tTAF亞基可作為一般TFD復(fù)合物的一個(gè)簡(jiǎn)單替代物表明，tTAF蛋白質(zhì)首先是與大量的染色質(zhì)共聚集在初級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞核中，但是大部分tTAF蛋白質(zhì)與TAF1-2不是集中在常染色質(zhì)上，而是在細(xì)胞核的亞區(qū)室中。這些人發(fā)現(xiàn)在初級(jí)精母細(xì)胞中，一小部分的tTAF染色與染色體聚集有關(guān)。一般表達(dá)的TFD的組成成分既不能在初級(jí)精母細(xì)胞中被檢測(cè)到而且與染色質(zhì)也沒(méi)有關(guān)系，且在細(xì)胞核中也不存在。令人驚奇的是，pc,polyhomeotic和dRing抑制復(fù)合物的所有成分首先

19、是聚集在初級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞核中，這與tTAFS模式是一致的。PRC1的細(xì)胞核聚集依賴于tTAFS的正常激活，在tTAFS突變的初級(jí)精母細(xì)胞中，PRC1的成分聚集在染色質(zhì)上，而不是細(xì)胞核中。這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一個(gè)假說(shuō)：tTAFS激活睪丸特異性基因表達(dá)的功能可能歸因于自己被抑制劑的抑制作用。在這種情況下tTAFS會(huì)使PRC1免于睪丸特異性靶激活子的激活作用，這樣就使其去抑制了。在睪丸樣品中中進(jìn)行的免疫沉淀法檢測(cè)顯示，tTAFS應(yīng)該是初級(jí)精母細(xì)胞中的靶激活子（這是樣品中唯一表達(dá)沉淀蛋白的細(xì)胞）然而，在野生型的睪丸中，pc受tTAF靶激活子的作用，與受非靶基因或基因間區(qū)域的激活子作用相比，pc沒(méi)有擴(kuò)增，相

20、反，卻與“抑制劑的抑制劑”假說(shuō)相一致。在tTAFS突變的睪丸中，pc在tTAF靶激活子的作用下擴(kuò)增，“tTAFS作為一個(gè)激活因子”和“抑制劑的抑制劑”兩種假說(shuō)不是互相排斥的。tTAFS可能既能除掉抑制劑（pc）又能作為激活子發(fā)揮作用。例如，募集Trithorax group復(fù)合物。Aly類基因產(chǎn)物形成睪丸特異性Myb-MUVB共源復(fù)合物當(dāng)aly基因被克隆出來(lái)時(shí)，我們知道它從植物體到動(dòng)物體都是很保守的（真菌中不是），aly基因唯一的同源基因已經(jīng)在其它系統(tǒng)中被研究了，這個(gè)系統(tǒng)就是線蟲的lin-9基因，這個(gè)基因涉及到synMUVB遺傳通路，該遺傳通路對(duì)線蟲的外陰感應(yīng)起著負(fù)調(diào)控的作用，那時(shí)，lin-9

21、基因調(diào)控C.線蟲中細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制還不清楚?；驕y(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，aly基因是果蠅中兩種lin-9基因共源的基因中的一種，另一種則是mip130基因。aly基因潛在功能的線索來(lái)自最近對(duì)其同源基因的分析。從卵巢提取物中純化得到的mip130蛋白，與果蠅Myb,CAF1以及之前不知道的兩種Mip120和Mip40構(gòu)成了一種復(fù)合物。這種復(fù)合物在細(xì)微的不同條件下再次被純化，并揭示了其含有更復(fù)雜的亞基，現(xiàn)在被稱作MMB或dREAM復(fù)合物。另外的一些亞基，包括果蠅Rbf，E2F2，DP和dlin-52，其中Myb,E2F2,DP以及Mip120是DNA的結(jié)合蛋白。dREAMMMB復(fù)合物主要功能似乎是抑

22、制基因的表達(dá)。令人興奮的是，C.線蟲synMUVB通路基因的克隆揭示了一個(gè)類似的基因序列，其產(chǎn)物形成DRM復(fù)合物，核心DRM復(fù)合物包括lin-35基因，Efl-1基因，DPL-1基因，lin-53基因，lin-37基因lin52和lin54基因，除此之外，還含有alymip130的同源基因lin-9基因。從人體細(xì)胞已經(jīng)提取純化的一種被叫做linc或DREAM的相似復(fù)合物。表3給出了這幾種相關(guān)復(fù)合物的成分。Mip40基因是一種在果蠅睪丸中高度表達(dá)的dREAMMMB亞基基因，利用它進(jìn)行免疫親和純化方法證明了睪丸特異復(fù)合物的存在，這種復(fù)合物被稱作是睪丸減數(shù)分裂阻滯復(fù)合物。一些tMAC成分在dREAM

23、復(fù)合物種被發(fā)現(xiàn)，一些則是dREAM復(fù)合物亞基的共源物質(zhì)，一些則只存在于tMAC中。通過(guò)對(duì)aly類基因減數(shù)分裂阻滯基因的遺傳分析，tMAC亞基中的三種成分已被確定。Comr基因編碼一種耐性蛋白，這種基因在果蠅基因組中很保守，但在更遠(yuǎn)的親緣物種中則找不到這種基因。當(dāng)我們第一次克隆comr基因時(shí)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找其序列，卻找不到與之相匹配的。但最近研究表明，它包含一個(gè)被公認(rèn)是DNA結(jié)構(gòu)域的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)。Topic基因是在與其直接作用的comr蛋白的基礎(chǔ)上克隆的，這種基因至少在昆蟲中是保守的，它包含有多鋅指模型，被公認(rèn)具有約束DNA的作用。我們通過(guò)aly基因蛋白的配體的結(jié)構(gòu)克隆了tomb基因，tomb基

24、因含有被預(yù)言為DNA連接域，并與dREAM成分Mip120共源的CXC基因。最后的aly減數(shù)分裂阻滯點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)遺傳學(xué)方法確定為achi和vis基因的重復(fù)點(diǎn)。編碼achi和vis蛋白，這與人類中的相互作用因子蛋白類似。Achivis蛋白與睪丸提取物中的aly和comr基因發(fā)生共免疫沉淀反應(yīng)，但與Mip140基因不發(fā)生共純化作用。這表明aly和comr至少存在于兩種不同的復(fù)合物種，一種復(fù)合物含有Mip140，缺乏Achivis，另一種則含有Achivis。 組織特異性基因dREAM與tMAC亞基被公認(rèn)是DNA連接蛋白，核心復(fù)合物成分，睪丸中表達(dá)的共源物與睪丸或組織中的不同的DNA連接蛋白的作用就是

25、確保睪丸中精子形成基因被特異的激活。dREAM和DRM復(fù)合物主要是在轉(zhuǎn)錄抑制方面發(fā)揮作用，而不是激活作用。盡管激活作用是由人類中復(fù)合物L(fēng)INC來(lái)發(fā)揮。這就引出了一個(gè)問(wèn)題，aly類減數(shù)分裂阻滯基因是直接作為轉(zhuǎn)錄激活子發(fā)揮作用，還是作為抑制因子對(duì)抑制因子發(fā)揮作用？支持潛在激活作用的一個(gè)證據(jù)：觀測(cè)結(jié)果表明，在初級(jí)精母細(xì)胞中，所有aly類蛋白質(zhì)與常染色質(zhì)發(fā)生共聚集作用，并且，這種聚集作用對(duì)其功能是必要的。Achivis。作為轉(zhuǎn)錄激活子的直接證據(jù)已經(jīng)通過(guò)對(duì)Achivis的強(qiáng)激活和強(qiáng)抑制發(fā)生的表達(dá)融合證實(shí)了。Achi-VP16融合蛋白的表達(dá)避免突變形狀的發(fā)生，而Achi-ERR基因的表達(dá)不能起到這個(gè)作用。

26、tTAFS和tMAC的交互調(diào)節(jié)利用原位雜交技術(shù)診斷RNA，將其分成aly類和can類減數(shù)分裂阻滯突變，這些有關(guān)蛋白編碼aly類基因成為tMAC亞基，使can類基因變?yōu)閠TAFS，然而mip40不符合這種分類，但顯然mip40突變體使can類的。這可能表明，mip40在平衡兩種復(fù)合物的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，這需要做進(jìn)一步的研究。睪丸特異性激活子 睪丸特異性基因只在睪丸中被激活，在果蠅的其它組追中則保持“沉默”，有點(diǎn)讓人吃驚的是，激活子成分與睪丸特異性存在很小的相關(guān)性。首先被研究的其中之一就是-微觀蛋白的同型物2微觀蛋白。令人驚訝的是，僅由啟動(dòng)子區(qū)域的一個(gè)長(zhǎng)53bp的片段，加上5UTR的第一個(gè)

27、長(zhǎng)71bp的片段就足以引起報(bào)告基因組的睪丸特異性表達(dá)。啟動(dòng)子上一個(gè)長(zhǎng)為14bp的片段2UE1，被證明對(duì)睪丸的特異性表達(dá)起著關(guān)鍵的作用。這個(gè)睪丸特異性的報(bào)道基因的表達(dá)依賴于減數(shù)分裂阻滯基因功能的正常發(fā)揮，例如，內(nèi)源性基因的表達(dá)。2UE1的相關(guān)序列被發(fā)現(xiàn)是其他幾種睪丸特異性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，但這個(gè)序列在其他睪丸激活子中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，所以，它不能被認(rèn)定是睪丸特異性表達(dá)的標(biāo)志序列。表3給出了其它幾種基因進(jìn)行睪丸特異性表達(dá)所需的最短序列。這些短的啟動(dòng)子大概含有睪丸特異性表達(dá)控制裝置的起始位點(diǎn)，tTAFS和tMAC，如上文所述。事實(shí)上，睪丸中的睪丸特異性控制元件非常小，并且可能對(duì)新基因的復(fù)制表達(dá)來(lái)說(shuō)很重要

28、。例如，睪丸特異性基因sdic是Annx基因和cdic基因的復(fù)制與融合進(jìn)化而來(lái)的Annx基因和cdic基因分別負(fù)責(zé)編碼膜蛋白和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白連接鏈。新生成的sdic基因編碼啟動(dòng)子是由Annx的編碼區(qū)和cdic基因的內(nèi)含子序列編碼產(chǎn)生的。 對(duì)基因組組織的觀察發(fā)現(xiàn)，睪丸特異性基因顯然聚集在基因組中。睪丸特異性基因的聚集很有可能與初級(jí)精母細(xì)胞或其他類型細(xì)胞中高度有序的染色質(zhì)有關(guān)。聚集的基因組區(qū)域在體細(xì)胞中保持“沉默”并且具有緊湊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。但是，如果將轉(zhuǎn)基因隨即插入基因組中，這在表達(dá)上也存在一些較小的差異。所以，盡管染色質(zhì)組織區(qū)域會(huì)促進(jìn)睪丸特異性基因的表達(dá)，但它對(duì)于確定正?；虻谋磉_(dá)水平并不重要?？?/p>

29、以很公平地說(shuō)，基因組環(huán)境與啟動(dòng)子序列對(duì)睪丸的特異性表達(dá)的相關(guān)重要性是復(fù)雜的，但這種復(fù)雜的無(wú)問(wèn)題至今未被解決。精子細(xì)胞伸長(zhǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng) 正如以上所論述的，在果蠅的睪丸中不存在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄的觀念已被廣泛接受。在初級(jí)精母細(xì)胞中，精子形成過(guò)程中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將會(huì)被進(jìn)行一個(gè)綜合處理并儲(chǔ)存起來(lái)，直到被利用時(shí)。精子形成過(guò)程中，一旦發(fā)生翻譯活動(dòng)，這些轉(zhuǎn)錄物質(zhì)就會(huì)活躍起來(lái)，這些轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的消失同時(shí)伴隨著蛋白質(zhì)的形成。這種現(xiàn)象在分析睪丸中普通基因的功能時(shí)非常有用。通過(guò)簡(jiǎn)單分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累與消失可以大致推測(cè)出蛋白質(zhì)的產(chǎn)生處于什么階段。在我的實(shí)驗(yàn)室中，我們針對(duì)這個(gè)目的做了許多的RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。我們?cè)诰蛹?xì)胞中檢

30、測(cè)到的大多數(shù)基因的產(chǎn)物的表達(dá)量與在初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)到的大致相同，這正如我們所預(yù)料的。然而，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與這個(gè)規(guī)律極不相符的一類很例外的基因，這個(gè)基因的染色結(jié)構(gòu)與精子形成過(guò)程中某個(gè)特殊時(shí)期的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一致。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，整體上是指在初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)到的表達(dá)量很低的“comets”和“cups”這些物質(zhì)在精子細(xì)胞伸長(zhǎng)階段的末尾時(shí)期表達(dá)水平很高。我們使用了單一囊定量RT-PCR模式，我們發(fā)現(xiàn)，在單一孤立的由初級(jí)精母細(xì)胞形成的囊中含有可檢測(cè)到的comet或cup轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并且，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在處于伸長(zhǎng)后期的精子細(xì)胞構(gòu)成的囊中由很高的水平。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們?cè)赗NA原位雜交中看到的模式。具有高轉(zhuǎn)錄活性

31、的初級(jí)精母細(xì)胞的細(xì)胞核的直徑約為17um，細(xì)胞核在精子頭部為球形時(shí)時(shí)直徑大約為6um，然而成熟精子細(xì)胞中的針形細(xì)胞核長(zhǎng)約9um，最大直徑約為0.3um，相比之下，胎盤合胞體的中期細(xì)胞核直徑大約為10um。因此在精子形成過(guò)程中涉及到其細(xì)胞核成200倍的減少，而在減數(shù)分裂和核的更新中體積僅減少20倍。精子細(xì)胞核開始伸長(zhǎng)并稍微變細(xì)，這涉及到體積的成5倍減少，并且在早期的canoe階段呈現(xiàn)一個(gè)不對(duì)稱的U形，在canoe階段的晚些時(shí)候，其又呈現(xiàn)為腎形。果蠅精子中的DNA是由細(xì)胞核中小的基礎(chǔ)蛋白，包括H1組蛋白，學(xué)術(shù)上稱為似魚精蛋白包裝起來(lái)的。這些賴氨酸豐富的蛋白質(zhì)在功能上與脊椎動(dòng)物中精氨酸豐富的魚精蛋白

32、相似。D.果蠅中的三種魚精蛋白都已被描述出來(lái)，即Mst35Ba蛋白（魚精蛋白A），Mst35Bb（魚精蛋白B）和Mst77F蛋白。這三種全部的蛋白存在于成熟的精子細(xì)胞的核中。在脊椎動(dòng)物體中，從核小體包裝到魚精蛋白的轉(zhuǎn)換是在轉(zhuǎn)移蛋白，包括TpI94D蛋白的促進(jìn)下進(jìn)行的。組蛋白-轉(zhuǎn)換蛋白-魚精蛋白的轉(zhuǎn)換發(fā)生在canoe階段的晚期，并且，細(xì)胞核體積的大量減少也是從這個(gè)階段開始的。對(duì)睪丸中表達(dá)的熒光標(biāo)記組蛋白，魚精蛋白和轉(zhuǎn)換蛋白進(jìn)行單一囊RT-PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)comet和cup轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物恰恰在開關(guān)之前出現(xiàn)，此時(shí)，大部分的細(xì)胞核DNA仍然不是在高度濃縮的狀態(tài)。在精子形成過(guò)程的canoe階段的晚期，可以

33、特異的檢測(cè)出活化的poly酶。盡管沒(méi)有直接檢測(cè)，但我們推測(cè)轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在充滿染色質(zhì)的核中。脊椎動(dòng)物精子細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的終止和脊椎動(dòng)物中組蛋白-轉(zhuǎn)換蛋白-魚精蛋白的開關(guān)時(shí)間關(guān)系并沒(méi)有被確定下來(lái)?，F(xiàn)在還不清楚的是轉(zhuǎn)錄的停止依賴于染色質(zhì)濃縮的啟動(dòng)，還是染色質(zhì)的濃縮依賴于轉(zhuǎn)錄的終止，或者是兩者在機(jī)制上是相互獨(dú)立的。減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄在哺乳動(dòng)物與果蠅中有一個(gè)明顯的不同，在哺乳動(dòng)物精子分化的早期階段，轉(zhuǎn)錄活動(dòng)是相對(duì)較高的，并且在染色質(zhì)濃縮時(shí)停止。在果蠅中，我們發(fā)現(xiàn)，在初級(jí)精母細(xì)胞階段的末期，轉(zhuǎn)錄大體上停止了，在精子形成的早期階段，我們并沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，而是在精子細(xì)胞伸長(zhǎng)的中期階段，我們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄能力突然被再次激活。 至少一種comet基因，soti對(duì)雄性的生育能力是必要的，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)，在soti基因純合的個(gè)體中是不能形成精子的。有趣的是，soti基因的雜合體是可育的，并且可以遺傳soti基因突變的染色體。因此，果蠅及哺乳動(dòng)物中的精子囊都是功能二倍體，32個(gè)單倍soti基因突變的精細(xì)胞可由囊中另外的32個(gè)精細(xì)胞的soti基因“拯救” 我們從大約1200個(gè)基因的原位雜交中確定了24個(gè)comet和cup基因。鑒于我們?nèi)狈ο到y(tǒng)的搜索方法，我們可能不能確定全部的減數(shù)分裂