果蠅精子形成過程中基因調(diào)控的分子機制

1、果蠅精子形成過程中基因調(diào)控的分子機制果蠅精子形成過程中基因調(diào)控的分子機制海倫.白-庫伯卡迪夫大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 博物館大街 CF10 3AX，UK通訊作者 海倫.白-庫伯 電子郵件地址：white-coopercf.ac.uk摘要：從形態(tài)上普通的細胞分化成為高度專一、能夠獨立生活、具有活力的細胞，精子細胞的分化需要大量基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)作用。這類產(chǎn)物的表達必須是在發(fā)育環(huán)境下進行調(diào)控，以確保正常的細胞分化。精子形成過程中的許多必要基因在動物體內(nèi)是不發(fā)揮作用的，也許在其它地方表達，但使用不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模板。因此，精子的形成過程是一個非常好的闡明組織特異性基因表達原理的系統(tǒng)。同樣，對于它本身的正確性也變

2、得有趣起來。在這里，我討論了果蠅精子形成過程中基因表達的調(diào)控，重點論述了雄性生殖細胞系中睪丸特異性基因的表達過程。 果蠅睪丸的解剖學(xué)和細胞生物學(xué)結(jié)構(gòu) 果蠅的睪丸是由肌肉和色素細胞組成的具有盲端的管狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，管中充滿了雄性生殖細胞和支持細胞。詳見Fuller在1993年對果蠅精子形成的詳細描述。在管的一端有一個厚的基底層區(qū)域，覆蓋著由20個有絲分裂后hub細胞構(gòu)成的小集群，它們構(gòu)成了一個維護正常干細胞的信號中心。分布在hub細胞周圍的是兩種干細胞群，生殖細胞系細胞的每一次減數(shù)分裂都會再產(chǎn)生一個生殖細胞系細胞，并且還產(chǎn)生一個精原細胞。（體細胞）囊狀祖細胞的每一次減數(shù)分裂都會再產(chǎn)生一個囊狀祖細胞

3、，并且還產(chǎn)生一個囊狀細胞。盡管囊狀祖細胞的分裂同樣也會產(chǎn)生新的hub細胞。兩種囊細胞都包裹住精原細胞，并形成了囊狀結(jié)構(gòu)，并且與哺乳動物睪丸中的支持細胞有相似的功能?，F(xiàn)在，這些囊狀細胞處于后有絲分裂期，與此同時，這些囊狀精原細胞經(jīng)過4次有絲分裂形成16個初級精母細胞。就像哺乳動物精子的形成一樣，形成精子的分裂也是以不完全胞質(zhì)分裂、姐妹細胞間以穩(wěn)定的胞質(zhì)橋梁相連接為特征。初級精母細胞迅速通過減數(shù)分裂前s期并進入持續(xù)超過3天的細胞循環(huán)G2期，在此期間，細胞體積明顯增大，經(jīng)過兩次減數(shù)分裂形成的64個圓的精子細胞仍然包在一個囊中。并且相互協(xié)調(diào)聯(lián)系產(chǎn)生極化，所以，這個囊狀結(jié)構(gòu)本身就是不對稱的。在精子細胞的

4、伸長階段，兩種囊細胞的不同之處變得明顯起來。頭部的囊細胞覆蓋在精子細胞的尾部，而尾部的囊細胞壓縮正在伸長的尾部。囊細胞調(diào)整精子的頭部朝向睪丸的底部，而尾部則朝向睪丸的頂端伸長。最后，充分伸長的精子細胞再進行個體化發(fā)育，在此期間，將擠出多余的細胞質(zhì)，個體發(fā)育完的精子細胞在睪丸的底部呈圓圈狀，直到被排入精囊中。果蠅睪丸中的基因表達原始的增值中心 在睪丸的頂端區(qū)域含有hub細胞，干細胞（生殖細胞系細胞和囊祖細胞）以及有絲分裂精原細胞囊，它們共同構(gòu)成了原始的生發(fā)中心。在這里，基因的特異性表達似乎涉及到干細胞的行為調(diào)節(jié)作用，促進干細胞發(fā)育成與hub基因相關(guān)的細胞，并且促進從hub中移走的細胞的分化。幾種

5、信號通路解釋了這一過程。包括所有種類干細胞的中JAK-STAT信號的激活，并與hub的配體進行反應(yīng)，以及生殖系細胞的和精原細胞的中DPP通路的激活。最近，這幾種通路在其它領(lǐng)域也受到了重視。有這些信號事件決定靶細胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄改變的研究已經(jīng)取得了進展。通過擴配的生殖系干細胞和擴配的精原細胞相比，發(fā)現(xiàn)，在hub或干細胞中的特異性表達上存在很少的相關(guān)基因。但是發(fā)現(xiàn)了一個在干細胞JKA-STAT信號通路潛在靶基因。一個把基因、鋅指同源-1以及轉(zhuǎn)錄因子是必須且足以囊祖細胞的，通過抑制與囊祖細胞分化的相關(guān)基因的表達，有趣的是，囊細胞中的鋅指同源-1的持續(xù)表達阻止了囊干細胞自身的表達以及生殖系細胞的非自主關(guān)閉

6、的分化。這表明，睪丸頂點區(qū)域的信號發(fā)生要比之前我們想的要復(fù)雜得多，并且，我們對兩種干細胞的行為上的協(xié)調(diào)作用的機制還不清楚。初級精母細胞的激活一個特異的轉(zhuǎn)錄程序?qū)τ谛坌陨诚导毎麃碚f，有絲分裂的完成以及進入精母細胞階段標志著一個戲劇性的轉(zhuǎn)折點。我不知道在動物的雄性生殖系干細胞和囊細胞中表示的任何一種基因是否在其它細胞中也表達，睪丸特異性基因的表達在精母細胞中被激活。20世紀60年代和70年代進行的將3H-尿苷整合到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實驗表明，在哺乳動物的精子中存在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄。相似的關(guān)于果蠅的影像研究表明，在成熟的初級精母細胞階段開始將3H-尿苷整合到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中沒有協(xié)調(diào)作用。因此，盡管減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄被

7、認為普遍存在于哺乳動物圓形的精子細胞中，但直到最近它才被認為在果蠅的精子形成過程中不存在。這表明，在精子形成過程中所需要的蛋白質(zhì)都是在初級精母細胞中轉(zhuǎn)錄形成的，并且一直都被儲存著，直到被需要利用。這包括，例如精子尾部的蛋白質(zhì)Donjuan以及許多其它的蛋白質(zhì)都是在初級精母細胞核中合成的，并且都保持著翻譯抑制狀態(tài)并持續(xù)幾天，直到精子形成的后期階段。脊椎動物中也是如此，盡管也存在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄，但都被染色質(zhì)的濃縮所抑制，并且在精子形成的后期需要依賴于儲存mRNA的翻譯。初級精母細胞中的基因表達 對成體的不同基因芯片分析表明，基因組織中大約50%的基因在睪丸中表達，并且在成體中檢測到的8%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

8、是睪丸特異性的，而且還有5%是在睪丸中擴增的。因此，與其它組織相比，睪丸中表達的全部基因中的25%是睪丸特異性的或者是在睪丸中擴增的，相似的研究表明，這些基因在睪丸中表達，但不是編碼蛋白質(zhì)的作用。精子中的全部蛋白質(zhì)被證實是由350種蛋白質(zhì)組成的，這些蛋白質(zhì)中的50%是睪丸中富含的或者是特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。令人欣慰的是，已知的精子特異性蛋白，例如B2-微管蛋白和胞質(zhì)動力蛋白都在數(shù)據(jù)庫中可以查到。睪丸特異性或是睪丸中擴增的基因大體上要分為兩類，一類是在其它組織（有時是睪丸）中表達的含有明顯的共源產(chǎn)物，另一類則是不含有共源產(chǎn)物。表1列出了這兩類基因的基因片段，表明了何種基因在果蠅的初級精母細胞中表達。這

9、個列表中顯示出了多種不同基因本質(zhì)上的分類，包括，代謝、胞質(zhì)骨架以及染色質(zhì)的組織等。然而或許是依據(jù)基因本質(zhì)上進行的睪丸特異性基因和睪丸蛋白質(zhì)分類所得出的結(jié)論就是，最大的一類是“無功能預(yù)測”在果蠅基因組中，僅限于睪丸特異性精子蛋白組基因本質(zhì)上的分析是特別引人注意的。這些基因中得很小一部分有功能預(yù)測，甚至在這些已經(jīng)進行了功能預(yù)測基因中很少進行過檢測，大多數(shù)基因的功能是不明確的。X染色體上基因的表達 已有實驗證據(jù)表明，在雄性中，對于基因發(fā)揮主要作用而言，X染色體不是一個非常好的地方，并且有一個X染色體的雄性偏置和睪丸偏置影響基因以外的一般模式。通過復(fù)制會產(chǎn)生一對基因，常染色體副本要比與X染色體相關(guān)的副

10、本更加具有睪丸偏置影響表達。潛在的進化力量推動了這些事件的進行，包括性antogonism，因為雄性是X單倍體，所以與X相關(guān)的等位基因的復(fù)制要比雌性花更多的時間，因此，變異對雄性有利而對雌性不利就被相應(yīng)的選擇出來了。精子形成過程中X染色體的失活將會給與X相關(guān)的精子形成基因的相對基因更強的選擇作用。這兩種力量共同推進了X染色體失活的假說。同樣，在脊椎動物精原細胞的減數(shù)分裂中X染色體也會失活。并且對于X染色體是在果蠅的初級精母細胞中失活的說法在較長時間內(nèi)存在爭議。這個觀測結(jié)果對一大類的睪丸中豐富的基因和一小類體細胞中豐富的基因都是正確的的。通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成精子的381種蛋白質(zhì)中只有43種是由

11、X染色體編碼的，這再一次證明了存在于X染色體上的鏡子基因的不足性。有趣的是，盡管如此，仍有大量的與X染色體相關(guān)的基因是在睪丸中特異性表達或擴增的。這表明，在這里確實有一些激活子發(fā)揮了作用。與全部的成體樣本相比，在睪丸中最豐富的50種基因中，13種存在于X染色體上。對于結(jié)構(gòu)基因，如sdic基因和與X染色體相關(guān)的筑絲蛋白基因家族的擴大串聯(lián)而言，X染色體的確是一個好的地方。最近一個將轉(zhuǎn)基因插入X染色體與插入常染色體在表達上的比較分析表明，至少有一種睪丸特異激活子要比插入常染色體中更高效的發(fā)揮了功能，盡管這個表達作用是在與X染色體相關(guān)的插入中檢測的。這表明，在X染色體上存在著一個較低水平的表達，盡管對

12、其它激活子的大部分觀察結(jié)果還未進行檢驗。減數(shù)分裂阻滯位點：初級精母細胞中基因表達的調(diào)控盡管在精子細胞分化的過程中有多種細胞內(nèi)事件的協(xié)調(diào)作用，遺傳分析表明，大多的形態(tài)上的事件都是獨立調(diào)節(jié)的。例如，精子細胞的伸長涉及到鞭毛軸絲的合成、線粒體融合以及線粒體衍生物的伸長和質(zhì)膜的極性生長等。突變的精子細胞fws中，保守的低聚高爾基體亞基，或是syntaxin5，它們都對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體物質(zhì)運輸非常重要，它們可以啟動軸絲和線粒體的伸長等，但在這些男性體內(nèi)（xu et al.2002,Farkas et al.2003）細胞不能生長，囊細胞也不能伸長.在精子突變體fzo中，絲裂融蛋白以及線粒體融合不能發(fā)生，

13、但精子細胞可以伸長。令人驚訝的是，精子細胞的分化并不完全依賴于減數(shù)分裂的完成，細胞周期激活因子交織引起精子細胞的突變，使細胞不能發(fā)生減數(shù)分裂而是使精子細胞發(fā)生分化成為4N，16個細胞構(gòu)成的囊狀過程。 盡管特別的形態(tài)事件發(fā)生具有獨立性，但遺傳學(xué)分析揭示了精子基因組程序是如何協(xié)調(diào)的。在精原細胞arrest發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)了一類“減數(shù)分裂阻滯”突變體，它們不能進行減數(shù)分裂或精子細胞的發(fā)生。雄性突變體睪丸中的減數(shù)分裂阻滯位點僅僅包括精子形成過程中直到成熟初級精母細胞的各個階段。這些睪丸中的初級精母細胞，它們既不進行減數(shù)分裂也不促進精子細胞的分化，在發(fā)生減數(shù)分裂阻滯突變的睪丸的底部區(qū)域明顯含有退化的細胞

14、。這些睪丸與患有成熟減數(shù)分裂精子細胞缺乏癥病人的睪丸相似。減數(shù)分裂阻滯位點分為兩種不同的表型對第一次減數(shù)分裂突變體的細胞核結(jié)構(gòu)檢測表明，can,mia,sa突變體中部分凝聚染色體的結(jié)構(gòu)與正常前期的結(jié)構(gòu)相似。相反的是，在aly基因突變的精母細胞中，染色體在形態(tài)上是非常分散的，并且染色體顯得非常模糊。為了弄明白減數(shù)分裂阻滯突變體是如何影響減數(shù)分裂和精子細胞分化的過程，我們檢測了幾種對這些過程十分重要的基因的表達情況。對初級精母細胞功能很重要的基因在突變的精母細胞中表達了，這表明，在初級精母細胞中，減數(shù)分裂阻滯基因不是轉(zhuǎn)錄的全部激活子。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)，精子形成過程中起重要作用的基因的mRNA

15、在can,mia,sa基因突變的初級精母細胞中表達量很低，并且在aly基因突變的初級精母細胞中檢測不到。aly基因突變體在細胞周期的轉(zhuǎn)錄方面與其它幾種突變體表現(xiàn)不同：aly基因突變體需要Twine基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但是can,mia和sa突變體需要的是轉(zhuǎn)錄后的Twine蛋白產(chǎn)物，因此，我們推斷，在初級精母細胞中，減數(shù)分裂阻滯基因?qū)D(zhuǎn)錄是很重要的，在精子形成過程中，主要的基因產(chǎn)物發(fā)揮作用。我們進一步推斷，減數(shù)分裂阻滯基因又可細分為aly基因類和can基因類兩類，且這種分類在最近關(guān)于減數(shù)分裂阻滯位點的發(fā)現(xiàn)中應(yīng)用。aly類基因突變體影響睪丸中多于1000種基因的轉(zhuǎn)錄，然而can類基因突變體則有些局限于

16、靶基因。大約有150種基因可以在can類基因突變體中表達，而在aly基因類突變體中則不能。而且，aly類基因的無效突變體明顯的削弱了靶基因的表達，盡管靶基因的表達作用減弱了，但在發(fā)生can類基因突變的睪丸中可以檢測到它。aly類基因的產(chǎn)物形成了睪丸特異性TFD共源復(fù)合物多亞基轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物TFD是由TATA-結(jié)合蛋白和多達12個TATA-結(jié)合蛋白相關(guān)因子構(gòu)成的，它在促進基因啟動子區(qū)域與RNA核糖核苷酸聚合酶之間的相互作用方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。can基因的克隆表明，它編碼了與無處不表達的TAF,dTAFS物質(zhì)共源的睪丸特異性物質(zhì)。mia,sa,rye基因的克隆表明，它們也編碼組織特異性物質(zhì)TAF

17、s，這就產(chǎn)生了一個假說，即存在一個無處不需要TAFs物質(zhì)的睪丸特異性區(qū)域。睪丸TFD物質(zhì)包含由can基因減數(shù)分裂阻滯位點編碼的TAFs，由TAF1和TAF2混雜而成。一個TAF1與同型的TAF1相連，并且在睪丸中大量擴增。假設(shè)這個啟動子與靶基因相互作用，則復(fù)合物中也會含有TBP（或幾種TBP相關(guān)蛋白的一種），盡管通常DNA連接活性是TBP賦予的，但也有可能由TAF1或2中的兩種AT-hook motifs所提供的。盡管睪丸TFD復(fù)合物的postulated與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫相一致，但值得注意的是，TAFs不僅是TFD的組成成分，而且還與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和PCG復(fù)合物相關(guān)，這使得功能預(yù)測變得更加困難。

18、tTAFs的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致產(chǎn)生了一個功能模型，其中它們僅僅是替代了通常表達的TFD復(fù)合物，并且具有轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，特別是作為精子形成基因的激活子。tTAF亞基可作為一般TFD復(fù)合物的一個簡單替代物表明，tTAF蛋白質(zhì)首先是與大量的染色質(zhì)共聚集在初級精母細胞的細胞核中，但是大部分tTAF蛋白質(zhì)與TAF1-2不是集中在常染色質(zhì)上，而是在細胞核的亞區(qū)室中。這些人發(fā)現(xiàn)在初級精母細胞中，一小部分的tTAF染色與染色體聚集有關(guān)。一般表達的TFD的組成成分既不能在初級精母細胞中被檢測到而且與染色質(zhì)也沒有關(guān)系，且在細胞核中也不存在。令人驚奇的是，pc,polyhomeotic和dRing抑制復(fù)合物的所有成分首先

19、是聚集在初級精母細胞的細胞核中，這與tTAFS模式是一致的。PRC1的細胞核聚集依賴于tTAFS的正常激活，在tTAFS突變的初級精母細胞中，PRC1的成分聚集在染色質(zhì)上，而不是細胞核中。這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一個假說：tTAFS激活睪丸特異性基因表達的功能可能歸因于自己被抑制劑的抑制作用。在這種情況下tTAFS會使PRC1免于睪丸特異性靶激活子的激活作用，這樣就使其去抑制了。在睪丸樣品中中進行的免疫沉淀法檢測顯示，tTAFS應(yīng)該是初級精母細胞中的靶激活子（這是樣品中唯一表達沉淀蛋白的細胞）然而，在野生型的睪丸中，pc受tTAF靶激活子的作用，與受非靶基因或基因間區(qū)域的激活子作用相比，pc沒有擴增，相

20、反，卻與“抑制劑的抑制劑”假說相一致。在tTAFS突變的睪丸中，pc在tTAF靶激活子的作用下擴增，“tTAFS作為一個激活因子”和“抑制劑的抑制劑”兩種假說不是互相排斥的。tTAFS可能既能除掉抑制劑（pc）又能作為激活子發(fā)揮作用。例如，募集Trithorax group復(fù)合物。Aly類基因產(chǎn)物形成睪丸特異性Myb-MUVB共源復(fù)合物當(dāng)aly基因被克隆出來時，我們知道它從植物體到動物體都是很保守的（真菌中不是），aly基因唯一的同源基因已經(jīng)在其它系統(tǒng)中被研究了，這個系統(tǒng)就是線蟲的lin-9基因，這個基因涉及到synMUVB遺傳通路，該遺傳通路對線蟲的外陰感應(yīng)起著負調(diào)控的作用，那時，lin-9

21、基因調(diào)控C.線蟲中細胞命運的機制還不清楚?；驕y序和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，aly基因是果蠅中兩種lin-9基因共源的基因中的一種，另一種則是mip130基因。aly基因潛在功能的線索來自最近對其同源基因的分析。從卵巢提取物中純化得到的mip130蛋白，與果蠅Myb,CAF1以及之前不知道的兩種Mip120和Mip40構(gòu)成了一種復(fù)合物。這種復(fù)合物在細微的不同條件下再次被純化，并揭示了其含有更復(fù)雜的亞基，現(xiàn)在被稱作MMB或dREAM復(fù)合物。另外的一些亞基，包括果蠅Rbf，E2F2，DP和dlin-52，其中Myb,E2F2,DP以及Mip120是DNA的結(jié)合蛋白。dREAMMMB復(fù)合物主要功能似乎是抑

22、制基因的表達。令人興奮的是，C.線蟲synMUVB通路基因的克隆揭示了一個類似的基因序列，其產(chǎn)物形成DRM復(fù)合物，核心DRM復(fù)合物包括lin-35基因，Efl-1基因，DPL-1基因，lin-53基因，lin-37基因lin52和lin54基因，除此之外，還含有alymip130的同源基因lin-9基因。從人體細胞已經(jīng)提取純化的一種被叫做linc或DREAM的相似復(fù)合物。表3給出了這幾種相關(guān)復(fù)合物的成分。Mip40基因是一種在果蠅睪丸中高度表達的dREAMMMB亞基基因，利用它進行免疫親和純化方法證明了睪丸特異復(fù)合物的存在，這種復(fù)合物被稱作是睪丸減數(shù)分裂阻滯復(fù)合物。一些tMAC成分在dREAM

23、復(fù)合物種被發(fā)現(xiàn)，一些則是dREAM復(fù)合物亞基的共源物質(zhì)，一些則只存在于tMAC中。通過對aly類基因減數(shù)分裂阻滯基因的遺傳分析，tMAC亞基中的三種成分已被確定。Comr基因編碼一種耐性蛋白，這種基因在果蠅基因組中很保守，但在更遠的親緣物種中則找不到這種基因。當(dāng)我們第一次克隆comr基因時，從數(shù)據(jù)庫中尋找其序列，卻找不到與之相匹配的。但最近研究表明，它包含一個被公認是DNA結(jié)構(gòu)域的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)。Topic基因是在與其直接作用的comr蛋白的基礎(chǔ)上克隆的，這種基因至少在昆蟲中是保守的，它包含有多鋅指模型，被公認具有約束DNA的作用。我們通過aly基因蛋白的配體的結(jié)構(gòu)克隆了tomb基因，tomb基

24、因含有被預(yù)言為DNA連接域，并與dREAM成分Mip120共源的CXC基因。最后的aly減數(shù)分裂阻滯點已經(jīng)通過遺傳學(xué)方法確定為achi和vis基因的重復(fù)點。編碼achi和vis蛋白，這與人類中的相互作用因子蛋白類似。Achivis蛋白與睪丸提取物中的aly和comr基因發(fā)生共免疫沉淀反應(yīng)，但與Mip140基因不發(fā)生共純化作用。這表明aly和comr至少存在于兩種不同的復(fù)合物種，一種復(fù)合物含有Mip140，缺乏Achivis，另一種則含有Achivis。 組織特異性基因dREAM與tMAC亞基被公認是DNA連接蛋白，核心復(fù)合物成分，睪丸中表達的共源物與睪丸或組織中的不同的DNA連接蛋白的作用就是

25、確保睪丸中精子形成基因被特異的激活。dREAM和DRM復(fù)合物主要是在轉(zhuǎn)錄抑制方面發(fā)揮作用，而不是激活作用。盡管激活作用是由人類中復(fù)合物L(fēng)INC來發(fā)揮。這就引出了一個問題，aly類減數(shù)分裂阻滯基因是直接作為轉(zhuǎn)錄激活子發(fā)揮作用，還是作為抑制因子對抑制因子發(fā)揮作用？支持潛在激活作用的一個證據(jù)：觀測結(jié)果表明，在初級精母細胞中，所有aly類蛋白質(zhì)與常染色質(zhì)發(fā)生共聚集作用，并且，這種聚集作用對其功能是必要的。Achivis。作為轉(zhuǎn)錄激活子的直接證據(jù)已經(jīng)通過對Achivis的強激活和強抑制發(fā)生的表達融合證實了。Achi-VP16融合蛋白的表達避免突變形狀的發(fā)生，而Achi-ERR基因的表達不能起到這個作用。

26、tTAFS和tMAC的交互調(diào)節(jié)利用原位雜交技術(shù)診斷RNA，將其分成aly類和can類減數(shù)分裂阻滯突變，這些有關(guān)蛋白編碼aly類基因成為tMAC亞基，使can類基因變?yōu)閠TAFS，然而mip40不符合這種分類，但顯然mip40突變體使can類的。這可能表明，mip40在平衡兩種復(fù)合物的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，這需要做進一步的研究。睪丸特異性激活子 睪丸特異性基因只在睪丸中被激活，在果蠅的其它組追中則保持“沉默”，有點讓人吃驚的是，激活子成分與睪丸特異性存在很小的相關(guān)性。首先被研究的其中之一就是-微觀蛋白的同型物2微觀蛋白。令人驚訝的是，僅由啟動子區(qū)域的一個長53bp的片段，加上5UTR的第一個

27、長71bp的片段就足以引起報告基因組的睪丸特異性表達。啟動子上一個長為14bp的片段2UE1，被證明對睪丸的特異性表達起著關(guān)鍵的作用。這個睪丸特異性的報道基因的表達依賴于減數(shù)分裂阻滯基因功能的正常發(fā)揮，例如，內(nèi)源性基因的表達。2UE1的相關(guān)序列被發(fā)現(xiàn)是其他幾種睪丸特異性轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，但這個序列在其他睪丸激活子中沒有被發(fā)現(xiàn)，所以，它不能被認定是睪丸特異性表達的標志序列。表3給出了其它幾種基因進行睪丸特異性表達所需的最短序列。這些短的啟動子大概含有睪丸特異性表達控制裝置的起始位點，tTAFS和tMAC，如上文所述。事實上，睪丸中的睪丸特異性控制元件非常小，并且可能對新基因的復(fù)制表達來說很重要

28、。例如，睪丸特異性基因sdic是Annx基因和cdic基因的復(fù)制與融合進化而來的Annx基因和cdic基因分別負責(zé)編碼膜蛋白和胞質(zhì)動力蛋白連接鏈。新生成的sdic基因編碼啟動子是由Annx的編碼區(qū)和cdic基因的內(nèi)含子序列編碼產(chǎn)生的。 對基因組組織的觀察發(fā)現(xiàn)，睪丸特異性基因顯然聚集在基因組中。睪丸特異性基因的聚集很有可能與初級精母細胞或其他類型細胞中高度有序的染色質(zhì)有關(guān)。聚集的基因組區(qū)域在體細胞中保持“沉默”并且具有緊湊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。但是，如果將轉(zhuǎn)基因隨即插入基因組中，這在表達上也存在一些較小的差異。所以，盡管染色質(zhì)組織區(qū)域會促進睪丸特異性基因的表達，但它對于確定正?；虻谋磉_水平并不重要?？?/p>

29、以很公平地說，基因組環(huán)境與啟動子序列對睪丸的特異性表達的相關(guān)重要性是復(fù)雜的，但這種復(fù)雜的無問題至今未被解決。精子細胞伸長時的轉(zhuǎn)錄活動 正如以上所論述的，在果蠅的睪丸中不存在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄的觀念已被廣泛接受。在初級精母細胞中，精子形成過程中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將會被進行一個綜合處理并儲存起來，直到被利用時。精子形成過程中，一旦發(fā)生翻譯活動，這些轉(zhuǎn)錄物質(zhì)就會活躍起來，這些轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的消失同時伴隨著蛋白質(zhì)的形成。這種現(xiàn)象在分析睪丸中普通基因的功能時非常有用。通過簡單分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累與消失可以大致推測出蛋白質(zhì)的產(chǎn)生處于什么階段。在我的實驗室中，我們針對這個目的做了許多的RNA原位雜交實驗。我們在精子細胞中檢

30、測到的大多數(shù)基因的產(chǎn)物的表達量與在初級精母細胞中檢測到的大致相同，這正如我們所預(yù)料的。然而，我們發(fā)現(xiàn)了一個與這個規(guī)律極不相符的一類很例外的基因，這個基因的染色結(jié)構(gòu)與精子形成過程中某個特殊時期的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一致。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，整體上是指在初級精母細胞中檢測到的表達量很低的“comets”和“cups”這些物質(zhì)在精子細胞伸長階段的末尾時期表達水平很高。我們使用了單一囊定量RT-PCR模式，我們發(fā)現(xiàn)，在單一孤立的由初級精母細胞形成的囊中含有可檢測到的comet或cup轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并且，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在處于伸長后期的精子細胞構(gòu)成的囊中由很高的水平。這些數(shù)據(jù)證實了我們在RNA原位雜交中看到的模式。具有高轉(zhuǎn)錄活性

31、的初級精母細胞的細胞核的直徑約為17um，細胞核在精子頭部為球形時時直徑大約為6um，然而成熟精子細胞中的針形細胞核長約9um，最大直徑約為0.3um，相比之下，胎盤合胞體的中期細胞核直徑大約為10um。因此在精子形成過程中涉及到其細胞核成200倍的減少，而在減數(shù)分裂和核的更新中體積僅減少20倍。精子細胞核開始伸長并稍微變細，這涉及到體積的成5倍減少，并且在早期的canoe階段呈現(xiàn)一個不對稱的U形，在canoe階段的晚些時候，其又呈現(xiàn)為腎形。果蠅精子中的DNA是由細胞核中小的基礎(chǔ)蛋白，包括H1組蛋白，學(xué)術(shù)上稱為似魚精蛋白包裝起來的。這些賴氨酸豐富的蛋白質(zhì)在功能上與脊椎動物中精氨酸豐富的魚精蛋白

32、相似。D.果蠅中的三種魚精蛋白都已被描述出來，即Mst35Ba蛋白（魚精蛋白A），Mst35Bb（魚精蛋白B）和Mst77F蛋白。這三種全部的蛋白存在于成熟的精子細胞的核中。在脊椎動物體中，從核小體包裝到魚精蛋白的轉(zhuǎn)換是在轉(zhuǎn)移蛋白，包括TpI94D蛋白的促進下進行的。組蛋白-轉(zhuǎn)換蛋白-魚精蛋白的轉(zhuǎn)換發(fā)生在canoe階段的晚期，并且，細胞核體積的大量減少也是從這個階段開始的。對睪丸中表達的熒光標記組蛋白，魚精蛋白和轉(zhuǎn)換蛋白進行單一囊RT-PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)comet和cup轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物恰恰在開關(guān)之前出現(xiàn)，此時，大部分的細胞核DNA仍然不是在高度濃縮的狀態(tài)。在精子形成過程的canoe階段的晚期，可以

33、特異的檢測出活化的poly酶。盡管沒有直接檢測，但我們推測轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在充滿染色質(zhì)的核中。脊椎動物精子細胞中轉(zhuǎn)錄的終止和脊椎動物中組蛋白-轉(zhuǎn)換蛋白-魚精蛋白的開關(guān)時間關(guān)系并沒有被確定下來?，F(xiàn)在還不清楚的是轉(zhuǎn)錄的停止依賴于染色質(zhì)濃縮的啟動，還是染色質(zhì)的濃縮依賴于轉(zhuǎn)錄的終止，或者是兩者在機制上是相互獨立的。減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄在哺乳動物與果蠅中有一個明顯的不同，在哺乳動物精子分化的早期階段，轉(zhuǎn)錄活動是相對較高的，并且在染色質(zhì)濃縮時停止。在果蠅中，我們發(fā)現(xiàn)，在初級精母細胞階段的末期，轉(zhuǎn)錄大體上停止了，在精子形成的早期階段，我們并沒有檢測到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，而是在精子細胞伸長的中期階段，我們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄能力突然被再次激活。 至少一種comet基因，soti對雄性的生育能力是必要的，因為我們發(fā)現(xiàn)，在soti基因純合的個體中是不能形成精子的。有趣的是，soti基因的雜合體是可育的，并且可以遺傳soti基因突變的染色體。因此，果蠅及哺乳動物中的精子囊都是功能二倍體，32個單倍soti基因突變的精細胞可由囊中另外的32個精細胞的soti基因“拯救” 我們從大約1200個基因的原位雜交中確定了24個comet和cup基因。鑒于我們?nèi)狈ο到y(tǒng)的搜索方法，我們可能不能確定全部的減數(shù)分裂