細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞分離技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法-細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù)一、從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，最常用的是機械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。1.胰蛋白酶 (trypsin)在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成34mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25溶解在無鈣鎂的平衡鹽

2、溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。在4孵育6到18小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。在組織碎片加入熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100200mm）過濾，分散所有剩余組織。計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。2.膠原酶 (collagenase)用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成34mm小片，用hanks平衡液（hbss）清洗組織碎片幾次。加入膠原酶（50200單位/ml，溶解在hbss中）。在37孵育4到18小時。加

3、入3mm cacl2增加解離效率。通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。通過離心在hbss中清洗懸液幾次。再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。3.dispase用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成34mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。加入dispase（0.62.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）在37孵育20分鐘到幾個小時。通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的dispase。通過離心在平衡鹽

4、溶液中清洗懸液幾次。再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。二、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用，每一種系統(tǒng)最佳條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗加以確定。再次培養(yǎng)時檢測細(xì)胞的活性。細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90對于無血清培養(yǎng)基，降低胰蛋白酶使用量。1. 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或edta(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層

5、，然后去除清洗液。3. 以23ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面。確保分離液覆蓋細(xì)胞層。在37孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內(nèi)，細(xì)胞就會脫落。細(xì)胞分離需要的時間因細(xì)胞系不同而有所變化。仔細(xì)監(jiān)測細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。4. 當(dāng)細(xì)胞完全分離時，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基，通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來分散細(xì)胞。計數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。5. 對于無血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用11（vv）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中

6、將抑制胰蛋白酶活性。第三節(jié) 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，最佳的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(70196)的特點。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在70以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過020階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。一、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，最小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和

7、轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：包含10甘油的完全培養(yǎng)基，包含10二甲基亞砜（dmso）的完全培養(yǎng)基，50 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50含有10甘油的新鮮培養(yǎng)基，或50 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50含有10二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：50 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50包含有7.5二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或包含有7.5二甲基亞砜和10細(xì)胞培養(yǎng)級bsa的新鮮無血清培養(yǎng)基。1.懸浮細(xì)胞計數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞

8、，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞。以1107到5107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5107到1107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。細(xì)胞以1/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70到-90的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。2.貼壁細(xì)胞使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時盡可能溫和，使對細(xì)胞的損傷減少到最小。在完全生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞。以51

9、06到1106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。細(xì)胞以1/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70到-90的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。二、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入完全生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對凍存劑（dmso或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入完全生長培養(yǎng)基中。1.直接鋪板方法取出貯存細(xì)胞，37水浴中快速融化。直接用完全生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用1020ml完全生長培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3105活細(xì)胞

10、/ml。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時，更換新鮮的完全生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。2.離心方法取出貯存細(xì)胞，37水浴中快速融化。把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml完全生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。以大約80x g離心2到3分鐘。棄去上清。在完全生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3105活細(xì)胞/ml。三、細(xì)胞的分化、衰老與死亡1細(xì)胞的分化:一個成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞：形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細(xì)胞均來自一個受精卵細(xì)胞。所以，通常把發(fā)育過程中，細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細(xì)胞分化。

11、細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個過程在人的一生中一直持續(xù)著。由旺盛生長不斷分裂的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中g(shù)1期開始時一個確定的點g0點“逃逸”出細(xì)胞周期。旺盛生長分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)和代謝活動各不相同。2細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗證明：成纖維細(xì)胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14-28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90-125次后衰老死亡。細(xì)胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時

12、，細(xì)胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。細(xì)胞衰老原因，尚無定論，出現(xiàn)過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說”。3細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個體存活的正常現(xiàn)象，常見的細(xì)胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細(xì)胞毒性。多細(xì)胞生物的生命活動中，因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死去，稱為細(xì)胞的病理死亡，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機理，如殺傷t細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。還有一種情況，一部分細(xì)胞的死亡是生物個體正常生命活動（代謝、生長、發(fā)育、分化）的

13、一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細(xì)胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細(xì)胞凋亡。 凋亡（apoptosis）則是程序性的、正常的細(xì)胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細(xì)胞的手段。它與細(xì)胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)還是生化的特征來說，都有明顯的區(qū)別。細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于生物界。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用，在多細(xì)胞動物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色。作為細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，凋亡失控的結(jié)果將是可怕的：凋亡不足時，易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾??；而凋亡過量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征（hiv）、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病，如老年性癡呆癥（alzheimers disease）、帕金森氏癥（parkinsons disease）。因此研究細(xì)胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別壞死形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹 ,全細(xì)胞裂解生化特征-離子內(nèi)環(huán)境失調(diào),非能量依賴性的（被動過程，在4c也可以發(fā)生）,隨機消化dna（電泳顯示為dna彌散狀態(tài)）,postlytic dna斷裂生理學(xué)特征-影響群組細(xì)胞 由非生理學(xué)因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等）,被巨噬細(xì)胞吞噬, 周圍有明顯的炎癥反應(yīng)凋亡形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽，但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、