病毒及其疫苗的生產制備技術

1、第 25 章 病毒及其疫苗的生產制備技術第一節(jié) 病毒的生產制備病毒需在活的敏感細胞中才能增殖，在細胞培養(yǎng)技術不成熟之前，人們?yōu)檠芯坎《荆?往 往采用雞胚接種或動物接種的方法來分離、 鑒定病毒或制備一定量的病毒液， 但這種方法因 個體和種屬差異， 不僅許多病毒難以找到合適的敏感動物， 而且即使在敏感動物中繁殖， 往 往個體差異大而影響結果的判定， 隨著細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展， 首先在病毒學研究方面獲得了 廣泛的應用，為病毒的繁殖、鑒定提供了來自不同動物（包括人） 、不同組織的細胞來源， 通過敏感性篩選， 目前絕大多數(shù)病毒均可有相應的敏感細胞， 為病毒的分離、 鑒定和增殖創(chuàng) 造了條件。 同時也為病毒的

2、大量生產提供了細胞來源， 隨著細胞大量生產技術的發(fā)展， 因此 對病毒來說只要有敏感的細胞，就可以進行大規(guī)模生產。一、病毒生產的目的和用途1、為了制備大量的病毒抗原，以制備病毒的亞單位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗 原制備免疫血清（抗體） 。2、為了制備病毒的減毒活疫苗或滅活的死疫苗，以用于預防接種。3、為了生產基因改造后或重組有其它多肽因子的病毒，以用于基因治療或殺腫瘤治療 及基因疫苗的預防接種。4、為了制備干擾素的病毒誘生劑（ NDV 、仙臺病毒等） ，用于干擾素的生產。5、生物戰(zhàn)用的病毒生物戰(zhàn)劑。常選用毒力強、抵抗力強、對不同國家人群最敏感的病 毒，又能通過氣溶膠或昆蟲和污染的水土進行傳播

3、的病毒。這是戰(zhàn)爭狂們正在開展的研究， 應警惕。二、病毒生產制備的方法1、動物接種，如狂犬病毒、腦炎蟲媒病毒采用鼠、兔腦內接種后收取腦組織制成懸液。2、雞胚、鴨胚接種：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F ）、仙臺病毒等，目前尚無敏感細胞，常采用910日胚齡的尿囊腔接種，37C孵育72小時收獲尿液，用雞紅血球測定血 凝效價。Q熱用7日齡鴨胚進行卵黃囊接種收獲卵黃囊，馬腦炎病毒常采用10日齡雞胚體接種，收獲全胚體液等。3、細胞培養(yǎng)法（詳見第二篇第 18 章） 不同的病毒選用相應的敏感細胞， 采用轉瓶培養(yǎng)、 多層培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)或懸浮攪拌培 養(yǎng)等方法 ,先大量增殖細胞，然后接種一定量的病毒,繼續(xù)培養(yǎng)適

4、當時間時，凍融細胞后，離心收獲上清。以上病毒大量生產后可制作病毒疫苗（死疫苗或減毒活疫苗） ，也可用來作干擾素誘生 劑或提取病毒表面抗原成分，但反對用作生物戰(zhàn)劑，危害人類健康和生命。第二節(jié) 病毒疫苗的生產制備病毒疫苗的生產制備與病毒的生產制備基本相同， 目前進行人工主動免疫， 用于病毒病 預防的疫苗有滅活疫苗（ Killed Vaccine） ,又稱死疫苗，減毒活疫苗（ Live Vaccine） ,亞單位 疫苗，多肽疫苗、基因缺失的減毒活疫苗，基因工程亞單位疫苗，重組牛痘多價疫苗。一、病毒疫苗的種類（一）滅活疫苗：目前常用的有流行性乙型腦炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍體細胞與地鼠腎細胞可用于生產狂

5、犬病病毒固定毒滅活疫苗），流感滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，以滅活病毒核酸而不影響其抗原性。（二）減毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通過動物傳代或細胞傳代篩選對人毒力低的變異株病毒。常用的有脊髓灰質炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯(lián)合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風疹聯(lián)合疫苗）。（三）亞單位疫苗：用化學試劑裂解病毒，提取包膜或衣殼上的亞單位，除去其核酸，以 此制成的疫苗稱亞單位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神經氨酸酶亞單位疫 苗。（四） 多肽疫苗：采用乙肝攜帶者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制備 的HBsAg基因表達

6、產物制備的疫苗。（五 ）基因缺失的減毒活疫苗：在病毒的基因組中，使其有毒力的相關基因發(fā)生缺失而制 成的減毒活疫苗稱基因缺失的減毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3區(qū)缺失株（第二代），單純皰疹病毒的a 22基因缺失株，目前有待進一步研究。（六） 基因工程亞單位疫苗：將病毒表面抗原基因，通過基因重組，在酵母或CHO細胞中進行表達亞單位多肽抗原成分而制成的疫苗，稱基因工程亞單位疫苗，如乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母和 CHO細胞中表達而提取獲得的純品HBsAg多肽。即將上市。（七）重組牛痘多價活疫苗。以牛痘苗為載體來表達數(shù)十種外源性病毒抗原基因，如：HAV、H

7、BV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，經基因重組后而 制成的牛痘苗病毒，經一次劃痕接種可使機體同時能獲得對多種病毒的免疫力，大大減少了接種次數(shù)。此外腺病毒和脊髓灰質炎病毒的活疫苗也可作為載體與輪狀病毒的抗原基因重組 后的活疫苗，經口服后可同時獲得兩種病毒的免疫力，有待于進一步研究、開發(fā)。上述病毒疫苗有的是采用細胞培養(yǎng)技術和細胞工程來進行生產制備的，現(xiàn)將采用細胞工程制備病毒疫苗種類和敏感細胞以及生產方式規(guī)于下表。二、細胞培養(yǎng)法制備的常用疫苗（如表25-1）。表25-1采用細胞培養(yǎng)法生產的常用病毒疫苗疫苗制備疫苗培養(yǎng)方法名稱活/死（疫苗株）的細胞脊髓灰滅活（Salk株）猴

8、腎細胞（原代/2-3代）轉瓶培養(yǎng)質炎疫苗活（Sabin 株）Vero細胞微載體培養(yǎng)腮腺炎活（ME株）幼地鼠、狗腎轉瓶培養(yǎng)疫苗豚鼠腎細胞羅氏瓶培養(yǎng)Edo mon ste 、原代雞胚纖維母麻疹活疫苗L16 、滬 191、細胞，人二倍體羅氏瓶培養(yǎng)Morate n、人羊膜、狗腎、羊腎轉瓶培養(yǎng)Schwar2 株豚鼠腎細胞單純瘡疹病毒疫苗死（ 72 株）兔腎、豚鼠腎 豚鼠胚成纖維細胞羅氏瓶培養(yǎng) 轉瓶培養(yǎng)巨細胞病毒疫 苗活（Towne 株）WI-38人胚肺細胞轉瓶培養(yǎng)狂犬病毒疫苗死（AV01/AV02 株）人二倍體細胞微載體培養(yǎng)（CUS株）流行性乙型 腦炎疫苗滅活（5-3株）人二倍體細胞多層滋養(yǎng)增殖器森林腦

9、炎 病毒疫苗滅活雞胚纖維母細胞 幼地鼠腎細胞轉瓶培養(yǎng)三、用細胞培養(yǎng)制備病毒疫苗的優(yōu)點：病毒疫苗的制備開始多用動物臟器、禽類胚胎（第一代疫苗）。然而因來源困難，很不經濟，制作麻煩，數(shù)量受限，更危險的是這些組織中間可能含有潛在致癌病毒和慢性病毒， 后改用原代細胞來制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙腦疫苗等，隨著細胞培養(yǎng)的發(fā)展，特別是自70年代后我國二倍體細胞株相繼建立，為疫苗生產創(chuàng)造了極為有利的基礎， 這比用原代細胞制備疫苗更優(yōu)越。如：（1）在細胞傳代期間可進行比較全面的檢查，特別是對潛在病毒和致癌性的檢查，確 保安全。（2）可使逐漸適應于無血清（或無蛋白）培基中生產繁殖，以排除過敏因素。（3

10、）可挑選對病毒敏感的細胞克隆。以利病毒在細胞中大量增殖，有助于疫苗產量的 提高。（4）易于大量生產和進行連續(xù)自動化工業(yè)生產，以滿足量的需求。國外已建立的二倍體細胞 WI-38、MRC-5、IMR-90等，國內已建立 KMB-17、2BS SL-7 等均已用于疫苗生產，如麻疹活疫苗、乙型腦炎疫苗、脊髓灰質炎疫苗、腮腺炎疫苗等，從 目前發(fā)展來看，用二倍體細胞制備疫苗將有取代其他原代細胞和傳代細胞的趨勢，但目前仍有一些病毒疫苗的制備還需用原代細胞，近年來有人主張用腫瘤細胞制備人用滅活疫苗。四、提高疫苗的效力常采用的方法：（1）細胞的藥物處理：用某些藥物處理細胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其方法為：

11、在細胞形成單層后，用一些化學藥物來處理，然后洗去，再接種病毒，就可使病毒提前成熟， 產量高，現(xiàn)列表如下：處理細胞的藥物刺激的病毒5-碘-2-脫氧尿核甙風疹、腺病毒、巨細胞病 SV-40維生素A或Tween-80脊髓灰質炎病毒、濾泡性口腔炎病毒膽固醇或卵磷質脊髓灰質炎病毒DEAE-dextra n脊髓灰質炎病毒、風疹痘類病毒，付流感病毒胰酶痘類病毒、呼吸道腸道病毒，流感病毒、鼻病毒二甲亞砜脊髓灰質炎病毒、流感、皰疹病毒放線菌素D麻疹、脊髓灰質炎病毒、付流感病毒（2）在維持液中補充某些物質也有利于某些病毒的復制、列表如下:增加的藥物刺激的病毒Tween-80或油酸鈉乙型腦炎谷氨酰胺麻疹、脊髓灰質炎

12、病毒、仙臺病毒精氨酸痘類病毒、皰疹病毒脯氨酸、賴氨酸乙型腦炎（3）毒種的選擇：經過空斑挑選產量高的大空斑毒株，精制毒種可提高病毒產量。（4）病毒液的濃縮：經濃縮后，病毒濃度增高，從而效價也隨之上升。五、影響疫苗質量的因素：（1）毒種：毒種的優(yōu)劣不僅影響疫苗的產量，而且也影響疫苗的質量，毒種不純會產生相互干擾，減毒活疫苗毒種若毒力回升易造成事故，因此毒種的選擇應挑選那些致病性低，免疫效價高而持久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產，可在傳代細胞上傳代的毒種。（2）培養(yǎng)病毒的細胞：細胞若有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不 能用作疫苗生產。對此因素應嚴格檢查。此外若細胞本身發(fā)生轉化后，不宜于

13、制備活疫苗， 只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。（3）培養(yǎng)液：培養(yǎng)細胞的營養(yǎng)液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會出現(xiàn)某種程度的過敏反應， 為此，應盡量使細胞適應于無血清蛋白的培養(yǎng)基中，以消除過敏源。（4）甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅活，但仍保持其抗原性，因此普遍用來制備 滅活病毒疫苗，但要控制含量。病毒被滅活的程度與滅活的溫度和甲醛的濃度等因素有密切關系。一般用熱滅活的方 法，采用在 37C滅活一定時間。經熱滅活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和穩(wěn)定性不受 影響，而且滅活病毒的溫度提高以后，滅活時間相對可以縮短，滅活劑的用量也可以減少。甲醛能刺激局部而引起疼痛和紅腫， 并有釋放組織

14、胺的作用。 因此制備疫苗時減少甲醛 濃度是必要的。如果疫苗內游離甲醛含量降低到一定程度后， 可考慮不需再用亞硫酸氫鈉來 中和甲醛。這對減少注射后疼痛及便于推廣預防接種有重要意義。六、生產病毒和制備病毒疫苗的常用方法（一）制備工藝流程（1）脊髓灰質炎病毒活疫苗制備工藝猴腎收獲病毒，合并，加 MgCb t 無菌試驗tB病毒檢查（兔腎細胞）t分亞批t 病毒滴定tB病毒復檢（家兔）t 分裝病毒滴定t結核桿菌檢查t 分裝t 病毒滴定t細胞培養(yǎng)J接種病毒（測0%正常細胞對照）J猴病毒檢查（獲腎細胞）（SV40）J病毒效價滴定J合并，過濾加 MgCl2J無菌試驗柯薩奇病毒檢查（乳鼠）-型特異性檢查JT特征試

15、驗猴體殘余致麻痹力試驗（安全試驗）病理切片J無菌試驗保存于-20 C待檢定合格后糖丸t加工脊髓灰質炎活疫菌工藝流程2、流行性乙型腦炎病毒死疫苗制備工藝地鼠腎|剪碎，胰酶消化地鼠腎細胞懸液37C,3天*細胞培養(yǎng)液，pH7.0pH7.2單層細胞洗滌細胞，去除牛血清10-410-5濃度病毒感染細胞1 32-34C培養(yǎng)23天收獲病毒液（收二次）按1:2000加入甲醛22C, 8 天滅活病毒液合并，安全及效力試驗T原液加入亞硫酸氨鈉半成品分裝成品檢定（包括理化性質，無菌試驗、安全試驗,防腐劑、試劑及殘余牛血清含量等） 合格成品（二）生產方法：病毒和病毒疫苗的生產方法基本相同，其規(guī)模取決于細胞生產規(guī)模，因

16、此上述介紹的細胞大量生產的方法和工藝均可用來生產病毒和病毒疫苗，可根據(jù)需要及適宜生產條件來選用培養(yǎng)裝置，如轉瓶培養(yǎng)，因設備簡單，便于生產單位采用。而多層培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，目前 國外已用于生產，我國仍在研究中。懸浮攪拌培養(yǎng)的簡易裝置已應用于疫苗生產，全自動懸浮發(fā)酵罐，在干擾素生產中有應用，但在疫苗生產中正在試用，下面著重介紹微載體培養(yǎng)法生產病毒的技術。1微載體懸浮培養(yǎng)細胞的病毒生產工藝作者選VSV病毒來接種經微載體培養(yǎng)的敏感細胞， 病毒的效價測定用 A549細胞（也可 用Wish或Hep-2細胞或雞胚纖維母細胞測 TCID 5。），病毒的效價為 6 Log TCID 50/m L， 用雞胚細胞空

17、斑法測定一般為 107Pfu/mL。 VSV在方瓶貼壁細胞中的增殖 （100mL方瓶，10mL培養(yǎng)基）待BHK21、BHK13、CHO-K 1細胞長滿單層，棄上清加入10-2VSV病毒懸液0.2ml, 37C吸附1小時，加病毒維持液培養(yǎng)20小時，于-30 C凍存，待測效價。 VSV在微載體懸液培養(yǎng)的細胞中增殖。微載體培養(yǎng)的 BHK21或BHK13、或CHO-K 1細胞，34天后細胞密度已達 1X 106細胞/mL靜置30分鐘i盡量吸去原培養(yǎng)基37C將10-2VSV病毒按50mL培養(yǎng)體積加入1mL病毒液于微載體細胞中37C 50r/min攪拌5分鐘靜置吸附1小時（每20分鐘攪拌2分鐘）I加入病毒

18、維持液至原體積| 37C繼續(xù)攪拌培養(yǎng)20小時于-30 C凍融后 2000 r/min低溫離心10分鐘收集上清，即為 VSV增殖的病毒液，分裝凍存，待測效價結果，在微載體懸浮培養(yǎng)的三株細胞所繁殖VSV病毒不僅產量大，而且病毒效價平均高1LogTCID 50，尤以CHO-K 1效價最高，平均可達7.75logTCID 50比原先的毒種效價還要高1.75LogTCID50,又起到了提高病毒效價的作用。此方法也可應用于生產病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感細胞能在微載體上大量生產。 若疫苗株是減毒活疫苗株，此法生產的病毒可直接制備活疫苗。若疫苗株為非減毒活疫苗株, 編輯版word此法生產的病毒可用甲醛滅活法制備死疫苗。2、轉瓶培養(yǎng)法此法是目前各大生物制品研究所常用于生產疫毒疫苗的方法， 如生產脊髓灰質炎病毒疫 苗，麻疹疫苗等。將細胞制備成懸液后，在溫室內（ 37C ）使支架以812轉/小時緩慢轉動，以使細胞 貼壁，當加入病毒后，待細胞出現(xiàn)+以上細胞病理性改變（CPE）時，標志病毒已大量繁殖， 此時收獲病毒，按生物