微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌屬檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌屬檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1. 概述分枝桿菌屬是一類細(xì)長(zhǎng)的、具有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)的需氧桿 菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脫色的特點(diǎn)，又稱為耐酸或 抗酸菌。分枝桿菌屬至今已發(fā)現(xiàn) 80 多個(gè)種，除結(jié)核分枝桿 菌和麻風(fēng)分枝桿菌外，其他分枝桿菌，如堪薩斯分枝桿菌、 恥垢分枝桿菌等，統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌。2. 標(biāo)本類型痰液、體液（包括腦脊液、腹水、胸水）組織，糞便等 標(biāo)本。3. 鑒定3.1 形態(tài)與染色：菌體細(xì)長(zhǎng)，或稍彎曲，兩端鈍圓，大 小為（ 0.20.5um ）x （15um）。革蘭染色不易著色，抗酸染色呈紅色。以 痰液直接涂片，結(jié)核分枝桿菌多為單個(gè)存在，有時(shí)呈V、Y 、人字形排列，痰菌量多

2、時(shí)可排列為束狀或集聚成團(tuán)。熒光染 料金胺“ 0”染色，在熒光顯微鏡下觀察呈金黃色熒光。3.2 培養(yǎng)特性： 結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢， 繁殖一代約需 18h，因此在羅氏固體培養(yǎng)基上需要培養(yǎng) 26 星期方可見到菌落。菌落多為 粗糙型， 不透明， 乳白為米黃色， 呈干燥顆粒狀， 形似菜花。 液體培養(yǎng)基中結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)較快，可形成表面菌膜或沉于管底。3.3 生化反應(yīng)：不發(fā)酵糖類，耐熱觸酶、耐熱磷酸酶和 吐溫 80 水解試驗(yàn)均陰性，尿素酶、中性紅、結(jié)核分枝桿菌煙酸、煙酰胺酶 和硝酸鹽還原試驗(yàn)均陽性。3.4 鑒別要點(diǎn)：3.4.1 本菌特征：菌體細(xì)長(zhǎng)，抗酸染色呈紅色；生長(zhǎng)緩 慢，菌落乳白或米黃色，呈干燥顆粒狀

3、， 形似菜花狀； 不發(fā)酵糖類， 尿素酶、 中性紅試驗(yàn)陽性。3.4.2 與牛分枝桿菌的鑒別：結(jié)核分枝桿菌菌體細(xì)長(zhǎng)， 煙酸、煙酰胺酶、硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陽性；牛分枝桿菌菌 體較短、 較粗， 煙酸、 煙酰胺酶、 硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性。3.5 操作步驟3.5.1 中性培養(yǎng)基3.5.1.1 標(biāo)本的處理痰液：挑取約 5ml 痰液至已標(biāo)記的 50ml 離心試管中， 加等量的 2%N- 乙酰半胱胺 - 氫氧化鈉前處理液(去污染) ；漩渦振蕩 20 秒； 靜置15分鐘，勿超過20分鐘；加無菌 PBS (pH6.8)至約 50ml,蓋緊蓋子；離心 3000r/min , 15分鐘；倒掉上清液；添 加 1-3ml

4、PBS(pH6.8) 以中和 pH 至 6.8.體液(包括腦脊液、腹水、胸水) ：無菌體液直接接種； 標(biāo)本量 10ml, 離心 3000r/min ， 15 分鐘，取沉淀物接種；污 染標(biāo)本，須同痰液處理方法后再接種。組織：加 1gNALC 至組織上溶解組織； 加 5ml7H9 肉湯， 以剪刀或研磨器將組織均勻研碎；取約 5ml 研磨液至標(biāo)記的 50ml 離心試 管中，加等量的 2%N- 乙酰半胱胺 -氫氧化鈉前處理液；漩渦 振蕩 20秒；靜置 15分鐘，勿超過 20 分鐘；加無菌 PBS( pH6.8 ) 至約50ml,蓋緊蓋子；離心3000r/min , 15分鐘；倒掉上清液； 添加 1-3

5、mlPBS(pH6.8) 以中和 pH 至 6.8.糞便：挑取約 1g 糞便至已標(biāo)記的 50ml 離心試管中， ； 加 5ml7H9 肉湯，混勻；等量的 2%N- 乙酰半胱胺 -氫氧化鈉 前處理液(去污染) ；漩渦振蕩 20 秒；靜置 15 分鐘，勿超 過20分鐘；加無菌 PBS ( pH6.8)至約50ml,蓋緊蓋子；離 心 3000r/min， 15 分鐘；倒掉上清液；添加 1-3mlPBS(pH6.8) 以中和 pH 至 6.8.3.5.1.2 固體培養(yǎng)基接種 無菌毛細(xì)管吸取消化液后標(biāo)本 0. 1 ml ,滴于中性羅-瓊培養(yǎng)基， 將接種過的斜面來回晃動(dòng)， 使菌液均勻鋪于 斜面上， 斜面朝

6、上放 37 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。 每一標(biāo)本同時(shí)接種 2 支。3.5.1.3 液體培養(yǎng)基接種 標(biāo)本接種前，在 BBL MGIT便培養(yǎng)管中先加入 0.5ml營(yíng)養(yǎng)添加劑（OADC ）和0.1ml雜菌抑菌劑（ PANTA ）。接種 0.5ml 標(biāo)本至 BBL MGIT 培養(yǎng)管中。 若一次處理標(biāo)本較多，可用營(yíng)養(yǎng)添加劑（ OADC ）直接溶解 雜菌抑菌劑（ PANTA ），在 BBL MGIT 培養(yǎng)管中 0.8ml 混合 添加劑；然后接種 0.5ml 標(biāo)本至 BBL MGIT 培養(yǎng)管中。3.5.2 酸性培養(yǎng)基培養(yǎng) 在約 5ml 痰液中加入等量的 4%nNaOH 溶液，漩渦振蕩 20 秒；靜置 15 分鐘，勿超過

7、 20 分鐘。無菌吸取消化后標(biāo)本 0.1ml 滴于酸性羅 -瓊培養(yǎng)基，將 接種過的斜面來回晃動(dòng)，使菌液均勻鋪于斜面上，斜面朝上 放 37 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每一標(biāo)本同時(shí)接種 2 支。3.6 結(jié)果觀察3.6.1 固體培養(yǎng)基 接種后 3 日、 7 日觀察，此后，每 周觀察一次。陽性結(jié)果涂片證實(shí)隨時(shí)報(bào)告。若 7 日內(nèi)報(bào)陽， 則為快速生長(zhǎng)菌，超過 7 日則為緩慢生長(zhǎng)菌。陰性結(jié)果至 8 周后報(bào)告，必要時(shí)可延長(zhǎng)。3.6.2 液體培養(yǎng)基 系統(tǒng)每天自動(dòng)記錄信號(hào)的變化而 測(cè)知有無分枝桿菌生長(zhǎng)，陽性結(jié)果經(jīng)涂片證實(shí)后報(bào)告。4. 檢驗(yàn)結(jié)果解釋與分析4.1 固體培養(yǎng)基報(bào)告方式菌落生長(zhǎng)不足斜面 1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（ N

8、個(gè)細(xì)菌）。菌落生長(zhǎng)占整個(gè)斜面 1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性 （ 1+）菌落生長(zhǎng)占整個(gè)斜面 1/2 菌落生長(zhǎng)占整個(gè)斜面 3/4 菌落生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)斜面 培養(yǎng) 8 周仍無菌落生長(zhǎng)4.2 液體培養(yǎng)基報(bào)告方式 42 日內(nèi)系統(tǒng)顯示養(yǎng)陽性， 桿菌液體培養(yǎng)陽性。分枝桿菌培養(yǎng)陽性 （ 2+）。 分枝桿菌培養(yǎng)陽性 （ 3+）。 分枝桿菌培養(yǎng)陽性（ 4+ ）。 分枝桿菌培養(yǎng)陰性 涂片染色抗酸桿菌陽性 分枝42 日內(nèi)系統(tǒng)顯示養(yǎng)陽性，涂片染色為非抗酸桿菌陽性標(biāo)本污染，請(qǐng)重送。涂片染色為無細(xì)菌生長(zhǎng) 分枝42 日內(nèi)系統(tǒng)顯示養(yǎng)陰性， 桿菌液體培養(yǎng)陰性。5. 藥敏6. 質(zhì)量控制以 結(jié) 核 分 枝 桿 菌 H37RV 為 陽 性 質(zhì)

9、控 ， 大 腸 桿 菌 ATCC25922 為陰性質(zhì)控，每次檢測(cè)均進(jìn)行質(zhì)量控制。7. 臨床意義 結(jié)核分枝桿菌為結(jié)核病的病原體，不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素， 其毒性物質(zhì)為索狀因子硫脂。人類對(duì)其有較高的易感性，最 易受損的器官是肺，絕大多數(shù)由呼吸道入侵導(dǎo)致感染和發(fā) 病，很少經(jīng)消化道和接觸感染。人類初次感染以后有較高的 免疫力， 可阻止入侵的細(xì)菌經(jīng)淋巴 -血流播散， 但不能預(yù)防再 感染。8安全防護(hù) 8.1所有操作均在生物安全柜中進(jìn)行。8.2檢驗(yàn)人員操作時(shí)要穿隔離衣，戴口罩和手套。8.3痰盒、試管、離心后上清液、剩余或廢棄物標(biāo)本等 污染物裝入生物危險(xiǎn)袋中，先浸泡消毒，再放入防漏容器中 經(jīng)高壓滅菌30分鐘后，才能丟棄或清洗。8.4實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以75%酒精噴灑安全柜臺(tái)面；