大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞——何久香課件

1、大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香1威斯騰生物技術(shù)中心 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香2v（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)v（二）腺病毒感染細(xì)胞大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香3v（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)v1、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備v2、脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離v3、脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香4v實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備：v 實(shí)驗(yàn)器械的高壓滅菌v 新生鼠的購買v 培養(yǎng)瓶的包被v （細(xì)胞培養(yǎng)前1-2 h，培養(yǎng)瓶用0.1多聚賴氨酸包被，置5C02培養(yǎng)箱

2、中，使用前用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗干凈，吸盡所有多余的DMEM/F12培養(yǎng)基后備用于種板）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香5v脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離v1、取新生乳鼠6只，75乙醇皮膚消毒。無菌條件下剪刀斷頭，打開脊椎后取出脊髓組織并置于盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，盡可能洗掉可能附著的表面血細(xì)胞。 v2、使用眼科鑷細(xì)致的剝離皮層表面蛛網(wǎng)膜，并取出脊髓，在該過程中可適當(dāng)撕開軟脊膜組織一并去掉脊髓組織深面的血管，隨后使用冰預(yù)冷DMEM/F12反復(fù)沖洗。大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香6v3在玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪將脊髓組織

3、剪碎致直徑0.3 mm左右小塊，在剪碎過程中避免擠壓脊髓組織，加入無菌3 ml 0.25胰酶，置37細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30 min至渾濁狀。 v4加入2-3 ml含10胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，靜置3 min后先用吸管吸去多余液體，再用吸管輕輕地吹打3次，收集細(xì)胞懸液，經(jīng)200目的不銹鋼網(wǎng)濾過除去雜質(zhì)，過濾后的細(xì)胞懸液移入10 ml無菌離心管中，然后800 rpm離心7 min。大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香7v5棄去上清液，然后每管加入2-3 ml含10胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，37、5CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min，進(jìn)行差速粘附貼壁

4、處理，以去除成纖維細(xì)胞。 v6輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出細(xì)胞懸液，種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶；繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種2-3 d后更換新的無菌培養(yǎng)基，隔2-3 d換新培養(yǎng)液1次。生長8-10 d待細(xì)胞融和后，置于37恒溫?fù)u床機(jī)中，180 rpm，14-16 h。 v7丟棄上清液，收集經(jīng)過搖床震蕩后的貼壁細(xì)胞，加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，即可得純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞。大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香8大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香9v脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)v細(xì)胞換液v對(duì)于貼壁細(xì)胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗23次，補(bǔ)加入新培

5、養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。v細(xì)胞傳代v對(duì)于貼壁細(xì)胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗23次，50ml培養(yǎng)瓶加入胰酶消化液約1ml，晃動(dòng)使消化液鋪均勻，置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，收集細(xì)胞至離心管，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，加培養(yǎng)液，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，按照1：2或1：3的比例傳代至無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香10v（二）腺病毒感染細(xì)胞v確定腺病毒的最佳感染滴度v腺病毒感染細(xì)胞大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香11v確定腺病毒的最佳病毒滴度（確定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板）孔板）v準(zhǔn)備細(xì)胞：800010000個(gè)細(xì)胞 /孔接種于96孔板v病毒稀釋：在離心管中用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀 釋，從10-1到10-7v病毒感染：將稀釋好的病毒接種到96孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100ul；設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照(兩縱排),只加維持液100ul。 v細(xì)胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱（375%CO2）， 培養(yǎng)5-7天v測定結(jié)果：取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變 ，并用Reed-Muench法 計(jì)算病毒的最佳滴度大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞何久香