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1、 研究生課程 分離方法基礎(chǔ)與技術(shù) 第 7 講 第6章 萃取分離法 (下) 第6章 萃取分離法 上講內(nèi)容 6.1 基本概念 6.2 主要萃取體系 6.3 影響萃取的各種因素 6.4 溶劑萃取實(shí)驗(yàn)技術(shù) 本講內(nèi)容 6.5 膠體萃取 6.6 雙水相萃取 6.7 固相萃取 6.8 超臨界流體萃取 6.5 6.5 膠體萃取膠體萃取 1.1.基本概念基本概念 膠體(膠團(tuán))萃取膠體(膠團(tuán))萃取被萃取物以膠體或膠團(tuán)形式被萃取。 膠體萃取也能用于無(wú)機(jī)物的分離,但應(yīng)用較少。 如:氯仿(或CCl4)萃取膠體金; 乙醚或氯仿萃取膠體銀或硫酸鋇。 正向微膠團(tuán):在水溶液中加入表面活性劑達(dá)到一定濃度時(shí), 會(huì)形成表面活性劑聚集

2、體(膠團(tuán)),在這種膠團(tuán)中,表面 活性劑的極性頭朝外(向水),而非極性尾朝內(nèi)。 反向微膠團(tuán): 與正相微膠團(tuán)相反, 當(dāng)向非極性溶劑中加 入表面活性劑達(dá)到一 定濃度時(shí),會(huì)形成憎 水非極性尾朝外(向 溶劑),而極性頭( 親水基)朝內(nèi)的膠團(tuán)。 膠團(tuán)大小在毫微米級(jí)。 正向微膠團(tuán) 反向微膠團(tuán) 生物物質(zhì)對(duì)分離體系的要求嚴(yán)格生物物質(zhì)對(duì)分離體系的要求嚴(yán)格 由于在分離過(guò)程中生物物質(zhì)容易被破壞,很多通常的 分離方法(如蒸餾)難以采用。 由于生物樣品一般粘度較大,過(guò)濾和超濾等也困難。 由于生物物質(zhì)(蛋白質(zhì))的親水憎油性,使其難溶于 一般有機(jī)溶劑;不適合通常的水相/有機(jī)溶劑相體系。 由于生物物質(zhì)直接與有機(jī)溶劑接觸會(huì)引起變

3、性。應(yīng)盡 可能避免直接接觸。 對(duì)生物物質(zhì)萃取所用溶劑的要求對(duì)生物物質(zhì)萃取所用溶劑的要求 能溶解蛋白質(zhì)并能與水分相,不破壞蛋白質(zhì)生物功能。 反向微膠團(tuán)對(duì)生物物質(zhì)的溶解反向微膠團(tuán)對(duì)生物物質(zhì)的溶解 反向微膠團(tuán)中有一個(gè)極性核心,它包括了表面活性劑的極 性頭組成的內(nèi)表面,平衡離子和水。此極性核心又稱“水 池(water pool)”,水池可以溶解極性分子,于是,極 性的生物分子就可以溶于有機(jī)溶劑而不直接接觸有機(jī)溶劑。 2. 蛋白質(zhì)的溶解模型蛋白質(zhì)的溶解模型 水殼模型水殼模型 蛋白質(zhì)居于“水池” 中心,水殼層則保護(hù) 了蛋白質(zhì),使其生物 活性不會(huì)改變。 陸九芳p125a 蛋白質(zhì)親水基插入蛋白質(zhì)親水基插入 反

4、向微膠團(tuán)中反向微膠團(tuán)中 僅蛋白質(zhì)的親水基插入 膠團(tuán)內(nèi)部的“水池”中, 而其親脂基團(tuán)露在膠團(tuán) 外面,與表面活性劑的 疏水劑或有機(jī)溶劑的碳 氫部分接觸。 陸九芳p125b 吸附模型吸附模型 蛋白質(zhì)分子吸附在 膠團(tuán)內(nèi)部由表面活 性劑親水頭組成的 親水壁上。 陸九芳p125c 溶解模型溶解模型 蛋白質(zhì)被幾個(gè)膠團(tuán)包 圍而溶解于表面活性 劑膠團(tuán),膠團(tuán)的非極 性尾與蛋白質(zhì)的親脂 部分直接作用。 陸九芳p125c 水殼模型是比較公認(rèn)的蛋白質(zhì)溶解機(jī)理 膠團(tuán)中水含量(0) “水池”中的水與正常水有所不同,特別是當(dāng)0相當(dāng) 低(如010)時(shí),其冰點(diǎn)通常低于00C。 蛋白質(zhì)表面的電荷與微膠團(tuán)內(nèi)表面的電荷之間的靜電 作用

5、對(duì)蛋白質(zhì)的溶解起重要作用。 表面活性劑的濃度 非極性溶劑中水的濃度 0 3. 影響膠團(tuán)萃取的主要因素影響膠團(tuán)萃取的主要因素 表面活性劑和溶劑種類對(duì)膠團(tuán)萃取的影響表面活性劑和溶劑種類對(duì)膠團(tuán)萃取的影響 表面活性劑多采用AOT(琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸 鈉) 陰離子表面活性劑 AOT作為反向微膠團(tuán)的表面活性劑的優(yōu)點(diǎn): 所形成的膠團(tuán)的含水率高(0為5060),比季銨鹽高 一個(gè)數(shù)量級(jí)以上; AOT形成反向微膠團(tuán)時(shí),不需要助表面活性劑。 有機(jī)溶劑通常采用異辛烷。表面活性劑AOT能迅速溶于 有機(jī)溶劑,也能溶于水而形成液晶態(tài)(非球狀)膠團(tuán)。 水相水相pH值對(duì)膠團(tuán)萃取的影響值對(duì)膠團(tuán)萃取的影響 蛋白質(zhì)為兩性

6、分子,各種蛋白質(zhì)有確定的等電點(diǎn)(pI), 當(dāng)pHpI時(shí),蛋白質(zhì)分子和表面活性劑內(nèi)表面都荷負(fù) 電,相互排斥,蛋白質(zhì)難溶于膠團(tuán)中。 pH過(guò)低時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)變質(zhì),溶解度也降低。 pH值對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響值對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響 離子強(qiáng)度增加, 減小了蛋白質(zhì)的 表面電荷與微膠 團(tuán)內(nèi)表面電荷的 相互作用,從而 降低蛋白質(zhì)在膠 團(tuán)中的溶解度。 陸九芳p127320 離子強(qiáng)度對(duì)膠團(tuán)萃取的影響離子強(qiáng)度對(duì)膠團(tuán)萃取的影響 4. 膠團(tuán)萃取分離過(guò)程膠團(tuán)萃取分離過(guò)程 制備含蛋白質(zhì)的反向微膠團(tuán)的三種方法制備含蛋白質(zhì)的反向微膠團(tuán)的三種方法 相轉(zhuǎn)移法相轉(zhuǎn)移法:將含蛋白質(zhì)的水相和含表面活性劑的有機(jī)溶 劑相接觸,在緩慢攪拌下,部分

7、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入有機(jī)相。此 過(guò)程較慢,最終得到的含蛋白質(zhì)有機(jī)相是穩(wěn)定的。 注入法注入法:向含表面活性劑的有機(jī)相中注入含蛋白質(zhì)的水 溶液。此過(guò)程較快,操作也很簡(jiǎn)單。 溶解法溶解法:適用于水不溶蛋白質(zhì)。將含水的反向微膠團(tuán)的 有機(jī)溶液與蛋白質(zhì)固體粉末一起攪拌。 制備含蛋白質(zhì)的反向微膠團(tuán)的三種方法制備含蛋白質(zhì)的反向微膠團(tuán)的三種方法 膠團(tuán)萃取膠團(tuán)萃取實(shí)例:實(shí)例:膠團(tuán)萃取分離3種蛋白質(zhì)(核糖核 酸酶、細(xì)胞色素C、溶菌酶) 表面活性劑:AOT;有機(jī)相:異辛烷 利用離子強(qiáng)度和pH值調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的溶解度差異。 pH=9,KCl=0.1M時(shí),核糖核酸酶不溶于膠團(tuán),留在水相。 進(jìn)入有機(jī)相膠團(tuán)中的細(xì)胞色素C和溶菌酶用pH=9

8、,KCl=0.5M的 水溶液反萃取,只有細(xì)胞色素C進(jìn)入水相。 仍留在有機(jī)相中的溶菌酶再用pH=11.5,KCl=2.0M的水相 反萃取。 陸九芳p128323 6.6 6.6 雙水相萃取雙水相萃取 1896年年Beijerinck發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn): (明膠瓊脂)或 (明膠可溶性淀粉) 混濁不透明溶液 兩個(gè)有界面的液相 兩相的主成分都是水 上相 富含明膠 下相 富含瓊脂 (或淀粉) 葡聚糖-甲基纖維素雙水相體系 等體積的等體積的2.2%2.2%葡聚糖與葡聚糖與0.72%0.72%的甲基纖維素的水溶液的甲基纖維素的水溶液 形成的雙水相體系形成的雙水相體系 上相上相: 0.39%葡聚糖 0.65%甲基纖維素

9、 98.96%水 下相下相: 1.58%葡聚糖 0.15%甲基纖維素 98.27%水 幾類雙水相體系幾類雙水相體系 聚合物聚合物水: 聚丙稀乙二醇甲氧基聚乙二醇 聚乙二醇聚乙烯醇 高分子電解質(zhì)聚合物水: 硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙稀乙二醇 羧甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素 高分子電解質(zhì)高分子電解質(zhì)水: 硫酸葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽 硫酸葡聚糖鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽 聚合物低分子量組分水: 聚丙稀乙二醇磷酸鉀 甲氧基聚乙二醇磷酸鉀 聚丙稀乙二醇葡萄糖 表面活性劑表面活性劑水: 生物物質(zhì)在雙水相體系中的分配生物物質(zhì)在雙水相體系中的分配 生物樣品的復(fù)雜性 分配機(jī)理的復(fù)雜性 包括可溶物(蛋白質(zhì)、核酸)、懸浮顆粒(細(xì)

10、胞或細(xì) 胞器); 各種物質(zhì)的大小、形狀和性質(zhì)不同; 存在形式不同(離解狀態(tài)、聚集狀態(tài)) 分配機(jī)理的解釋 界面張力作用 電位差作用(Donnan效應(yīng)) 界面張力作用界面張力作用 微小粒子在液體中由于熱運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)分布,界面張力 的影響使它呈不均勻分布,并聚集在雙水相體系中具 有較低能量的一相中。 電位差作用電位差作用 帶電大分子(粒子)在兩相中分配時(shí),會(huì)在兩相產(chǎn)生 電位Donnan效應(yīng)。Donnan效應(yīng)使得某些物質(zhì)選擇性 地通過(guò)Donnan膜,即某種(類)物質(zhì)在某相富集。 影響分配的因素影響分配的因素 聚合物的組成和濃 度 pH值:影響兩相 的電位差。 鹽的種類和濃度 陸九芳p137330 雙水相

11、萃取體系的應(yīng)用雙水相萃取體系的應(yīng)用 酶、核酸、生長(zhǎng)激素、病毒 等生物物質(zhì)的分離純化 萃取流程(右圖) 聚乙二醇(PEG)-磷酸鹽 體系萃取酶 1. 目標(biāo)酶進(jìn)入富PEG上相; 2. 富PEG上相中加鹽后形成新 雙水相,目標(biāo)酶進(jìn)入上相。 3. 富PEG上相中加鹽后形成新 雙水相,目標(biāo)酶進(jìn)入下相。 破碎的細(xì)胞 PEG/磷酸鹽 下相: 上相產(chǎn)物:目標(biāo)蛋白質(zhì) 細(xì)胞碎片、雜蛋 鹽 白、核酸、多糖 形成PEG/磷酸鹽體系 下相:核酸、 上相產(chǎn)物:目標(biāo)酶 雜蛋白、多糖 鹽 形成PEG/磷酸鹽體系 下相:目標(biāo)酶 上相:PEG,蛋白質(zhì) 雙水相體系的特點(diǎn):雙水相體系的特點(diǎn): 體系中水含量達(dá)7090,組成雙水相的高聚

12、物及某些無(wú) 機(jī)鹽不會(huì)導(dǎo)致生物物質(zhì)失活,有時(shí)還有保護(hù)作用。 可直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需蛋白質(zhì), 還能不經(jīng)破碎直接提取細(xì)胞內(nèi)酶。 易于進(jìn)行工業(yè)放大,處理量可以較大。 萃取后,含有聚合物的目標(biāo)產(chǎn)物可以采用常用的分離手段 (超濾、電泳、色層分離等)將聚合物除掉。 6.7 6.7 固相萃取固相萃取 固相萃取固相萃?。?以固體吸附劑作固定相,被測(cè)物或干擾物吸附到固定 相中,使被測(cè)物與樣品基體或干擾組分得以分離。 主要用于樣品前處理。 操作與柱層析(色譜)類似。 往往同時(shí)使被測(cè)物得到富集。 固相萃取的特點(diǎn)(與溶劑萃取比)固相萃取的特點(diǎn)(與溶劑萃取比) 是目前生物、醫(yī)藥、環(huán)境、食品等領(lǐng)域備受歡

13、 迎的樣品前處理(分離和富集)技術(shù)。 操作簡(jiǎn)單、快速; 減少乳化現(xiàn)象; 可處理大量樣品; 不需要使用大量有機(jī)溶劑; 應(yīng)用樣品對(duì)象十分廣泛。 固相萃取原理固相萃取原理 是發(fā)生在固定相和流動(dòng)相之間的物理過(guò)程,其實(shí)質(zhì)就是液 相色譜色譜分離過(guò)程,只不過(guò)用于樣品前處理的分離要求 不是很高,只需將大量基體物質(zhì)或其他干擾組分與被測(cè)物 分離,即對(duì)柱效的要求不高。 同液相色譜中分離柱的原理一樣,固相萃取也是基于待測(cè) 組分與樣品基體在固定相上吸附和分配性質(zhì)的不同來(lái)進(jìn)行 分離的。 固相萃取的目的與要求固相萃取的目的與要求 待測(cè)組分在固定相上沒(méi)有保留待測(cè)組分在固定相上沒(méi)有保留從樣品中除去大 量基體; 待測(cè)組分牢固地吸

14、附在固定相上待測(cè)組分牢固地吸附在固定相上從復(fù)雜基體中 將待測(cè)組分分離富集出來(lái); 與液相色譜不同的是,固相萃取并不需要特別好 的峰形和相當(dāng)短的分析時(shí)間。 固相萃取的主要萃取模式固相萃取的主要萃取模式 與LC分離模式相同,有正相固相萃取、反相固相萃取、吸 附固相萃取和離子交換固相萃取; 不同的萃取模式所使用的固定相不同; 固定相選擇原則也與LC相同,主要依據(jù)被測(cè)物和基體物質(zhì) 的性質(zhì),被測(cè)物極性與固定相極性越相似,則被測(cè)物在固 定相中的保留就越強(qiáng); 固相萃取所用的固定相也與LC常用的固定相相同,只是粒 度稍大一些(約30-50m)。 正相固相萃取正相固相萃取 采用極性固定相,可從非極性溶劑樣品中萃取

15、有機(jī)酸、 碳水化合物和弱陰離子等極性物質(zhì)。 被萃取的極性化合物在固定相上保留的強(qiáng)弱取決于其極 性基團(tuán)與固定相表面極性基團(tuán)之間的相互作用(氫鍵、 -鍵、偶極間相互作用等)。 固定相主要是以硅膠為載體的二醇基、丙氨基小柱。 反相固相萃取反相固相萃取 采用非極性或弱極性固定相,適用于萃取從非極性至 中等極性的化合物; 應(yīng)用對(duì)象最廣泛,是樣品前處理中使用最多的一種固 相萃取模式; 被萃取物與固定相間主要是基于范德華力和色散力的 疏水相互作用; 使用的固定相主要是在硅膠載體表面鍵合了疏水性烷 烴,如18烷、辛烷、二甲基丁烷。 離子交換固相萃取離子交換固相萃取 采用離子交換劑固定相,用來(lái)萃取有機(jī)和無(wú)機(jī)離子

16、性 化合物,如有機(jī)堿、氨基酸、核酸堿、離子性表面活 性劑等。 被萃取離子因與固定相表面的離子交換基團(tuán)之間的靜 電相互作用而保留,所用離子交換劑通常是在硅膠載 體表面接上季銨基、磺酸基、碳酸基等。 吸附固相萃取吸附固相萃取 以吸附劑(氧化鋁、硅膠、石墨碳材料、大孔吸附樹(shù)脂 等)作固定相; 除石墨碳材料和大孔吸附樹(shù)脂也可以萃取非極性物質(zhì)外, 吸附固相萃取主要用于極性化合物的萃取。 吸附固相萃取在樣品前處理中的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。 固相萃取裝置 簡(jiǎn)易固相簡(jiǎn)易固相 萃取儀萃取儀: 萃取小柱 真空萃取箱 蠕動(dòng)泵 SPE真空裝置 能同時(shí)處理多個(gè)樣 品 ,利用其獨(dú)特的 轉(zhuǎn)動(dòng)上蓋 ,可方便 地在 SPE各步驟間

17、任意切換 ,以收取 所需要的組分。 自動(dòng)固相萃取系統(tǒng) 儀器操作原理 在進(jìn)行柱預(yù)處理、樣品 添加、柱的洗滌、干燥 時(shí) , 支架如圖 所示位于托盤的前方位 置。接著 ,安裝在機(jī)械臂 上的移液針將支 架移動(dòng)到托盤后面的位 置 ,使柱位于相應(yīng) 的洗脫液收集管上方并 將洗脫下來(lái)的化合物收 集在收集管中. 固相萃取與色層分離、萃取色層的區(qū)別固相萃取與色層分離、萃取色層的區(qū)別 固相萃取固相萃取 色層分離色層分離 萃取色層萃取色層 兩相 固/液 固/液 液/液(水) 固定相制備 鍵合、化學(xué)修飾 鍵合、化學(xué)修飾 液體附于固體載體 固定相種類 較多 很多 較少 分離機(jī)理 吸附、分配、交換等 吸附、分配、交換等 分

18、配 柱尺寸 小,(35)cm X 1cm 大,(20100)cm X 5cm 中等 主要用途 樣品前處理 分離、純化、工業(yè)制備 無(wú)機(jī)分離 殘余硅醇基 非極性固定相通常采用封尾技術(shù)將硅膠表面的殘余硅醇基 屏閉,但極性或離子交換固定相通常不封尾。 封尾程度非常重要,因?yàn)闅埩艄璐蓟鶎?duì)化合物的保留和洗 脫起著不可忽視的作用。即使采用最嚴(yán)格的封尾方法,也 只能將鍵合相形成后剩余的70%的硅醇基團(tuán)封住。因此, 那些殘留硅醇基還會(huì)在待測(cè)組分的分離中發(fā)揮作用。 殘余硅醇基的作用 在pH小于2時(shí),硅醇基不帶電荷;pH大于2時(shí),硅醇基逐漸 離解而帶負(fù)電荷,從而影響萃取。 靜電相互作用比疏水相互作用更強(qiáng),因此,如果

19、存在混合 保留機(jī)理,必須采取措施減小或擴(kuò)大殘留硅醇基的影響。 例如,固相萃取法萃取胺時(shí),帶正電荷的胺與帶負(fù)電荷的 硅醇基形成非共價(jià)鍵,很難離解。為了降低硅醇基的影響, 最好選擇封尾的固定相。 殘留硅醇基可用三乙胺或醋酸銨等競(jìng)爭(zhēng)堿來(lái)屏蔽。 殘余硅醇基的利用 使用沒(méi)有封尾的固定相和pH4的緩沖溶液以保證殘余硅醇 基離子化。推薦采用緩沖溶液作為二級(jí)調(diào)節(jié)溶劑是因?yàn)樗?的pH值是波動(dòng)的,而且沒(méi)有緩沖能力。 實(shí)例(血漿中舒喘寧的測(cè)定):未封尾的硅膠萃取小柱先 用甲醇和水活化,血漿流經(jīng)萃取柱,帶正電荷的舒喘寧通 過(guò)與硅醇基的相互作用被萃取在柱上。先用水然后用乙腈 沖洗固定相以消除有可能產(chǎn)生干擾的成分。最后用

20、含有 0.5%醋酸銨的甲醇溶液將舒喘寧從萃取柱上洗脫下來(lái),作 為后續(xù)分析的樣品。 相互作用能相互作用能 待測(cè)組分可以通過(guò)氫鍵、偶極-偶極相互作用、疏水?dāng)U散力、 靜電相互作用等機(jī)理保留到固定相上。在萃取中,這些作用 機(jī)理可能單獨(dú)存在,也可能多種分離機(jī)理同時(shí)存在。了解是 哪些力在起作用,有利于制訂特效的分離方法。 各種鍵合力的能量相差較大。疏水鍵合能(偶極-偶極,偶 極-誘導(dǎo)偶極,擴(kuò)散相互作用):110kcal/mol;極性基團(tuán) 間的氫鍵:510 kcal/mol,這種類型的相互作用在硅膠表 面發(fā)生的機(jī)會(huì)較多。相反電荷間的離子或靜電相互作用: 50200 kcal/mol。 有機(jī)高分子聚合物固定相

21、有機(jī)高分子聚合物固定相 也是利用范德華力、氫鍵、離子相互作用、偶極-偶極相互吸 引等機(jī)理進(jìn)行分離。與硅膠載體的固定相相反,有機(jī)聚合物 固定相沒(méi)有由硅烷醇或痕量金屬引起的附加效應(yīng)干擾待測(cè)組 分在固定相表面的吸附。 非極性物質(zhì),如脂肪、蠟、碳?xì)浠衔铩㈩愔惡头枷泐惢?合物,可以強(qiáng)烈地吸附在這類固定相上,如果采用溫和的洗 脫條件,上述非極性物質(zhì)可以與極性或離子性污染物分離。 如果抑制離子型化合物的離解,使它們成為“電中性”的, 它們也能在有機(jī)聚合物固定相柱上保留,然后通過(guò)改變淋洗 液的pH將它們從柱上洗脫下來(lái)。 固相萃取操作 基本步驟:基本步驟: 用甲醇等溶劑活化固定相; 用水或緩沖溶液(有時(shí)也用

22、不含被測(cè)物質(zhì)的空白溶液) 平衡萃取柱; 將樣品負(fù)載在萃取柱上; 用水或緩沖溶液沖洗萃取柱,以消除樣品基體; 用流動(dòng)相或溶劑將待測(cè)組分從萃取柱上洗脫下來(lái); 最后將流出液直接或經(jīng)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行后續(xù)分析。 用有機(jī)溶劑(如甲醇)潤(rùn)濕柱子的目的 消除萃取柱中可能會(huì)干擾待測(cè)組分的有機(jī)雜質(zhì); 打開(kāi)碳鏈,增加萃取柱與待測(cè)組分相互作用的表面積, 也就是通常所說(shuō)的活化。如果不進(jìn)行這一步,就會(huì)減少 待測(cè)組分的保留,影響回收率,而且有可能出現(xiàn)干擾峰。 用純水或合適的緩沖溶液沖洗吸附床將消除過(guò)量的甲醇, 調(diào)節(jié)柱子的表面,為樣品的負(fù)載作準(zhǔn)備。 實(shí)例實(shí)例1. 1. HPLC測(cè)定人血清中膽汁酸的樣品前處理。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)驗(yàn)過(guò)程

23、: SPE柱( ODS柱)先后用5ml甲醇和5ml水預(yù)處理; 100L血清樣品中加入4ml 0.4mol/L NaHCO3上樣; 樣品通過(guò)柱子后,用20mL水沖洗; 再用2mL甲醇將膽汁酸洗脫; 在45下用N2將洗脫液吹干,以丙酮定容至1mL,衍生化; 取20L樣品做HPLC分析(ODS柱)。 右圖為經(jīng) SPE處 理并衍生后膽汁 酸的HPLC譜圖。 SPE預(yù)處理已基 本去除了人血清 中其它物質(zhì)對(duì)膽 汁酸的干擾。 實(shí)例2. 固相萃取分離提純紫杉醇 紫杉醇是一種具有獨(dú)特抗癌機(jī)理的天然抗癌藥 物,它對(duì)乳腺癌和卵巢癌等有特殊的療效。簡(jiǎn)化 紫杉醇的提純工藝 ,降低成本 ,是紫杉醇走入市 場(chǎng)的一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵

24、。 固相萃取方法固相萃取方法 (使用Sep-Pak C18硅膠載體柱) 活化活化: 往柱中依次加入 1 0乙酸乙酯、甲醇和 0.01mol/L pH5.0的乙酸銨水溶液并抽干。 樣品上柱樣品上柱: 將100mg紅豆杉浸膏溶解于40%60%的甲醇 /乙酸銨水溶液后加到柱中,抽干。 雜質(zhì)淋洗雜質(zhì)淋洗: 先用10ml的含20%甲醇的乙酸銨緩沖液淋洗 并抽干,然后用10ml含60%甲醇的乙酸銨淋洗。 紫杉醇洗脫紫杉醇洗脫:在淋洗好的柱子中加入10ml含80%甲醇的乙 酸銨,收集洗脫液,減壓蒸干.紫杉醇的質(zhì)量控制可用HPLC分 析。 紫杉醇的常壓反相層析精制 經(jīng)固相萃取初分離的紫 杉醇 ,再用C18 常

25、壓層析 進(jìn)一步純化。 50乙腈水溶液為洗脫 劑,可使紫杉醇的含量 從 10%提高到95%; 紫杉醇回收率95%。 固相微萃?。⊿PME) 1989年加拿大Pawliszyn等提出。 SPME是基于固相與樣品之間的平衡而建立起來(lái)的集進(jìn) 樣、萃取、濃縮功能于一體的技術(shù)。 通過(guò)石英纖維頭表面的高分子涂層對(duì)樣品中的有機(jī)分 子進(jìn)行萃取和預(yù)富集,使樣品預(yù)處理過(guò)程大為簡(jiǎn)化, 提高了分析速度及靈敏度。 固相微萃取通常與HPLC,CE在線聯(lián)用。 管外固相微萃取管外固相微萃取 采用傳統(tǒng)的外表涂有涂層的纖維頭,其SPME-HPLC聯(lián)用 界面包括一個(gè)六通進(jìn)樣閥和一個(gè)解吸池,樣品萃取后, SPME纖維頭浸入解吸池中用適

26、當(dāng)溶劑解吸,之后將閥切 換至進(jìn)樣位置用HPLC分析檢測(cè)。 Saito等發(fā)展了SPME與-HPLC的聯(lián)用接口。SPME與- HPLC聯(lián)用接口的三通具有合適的尺寸,使解吸效率很高, 同時(shí)與微分離系統(tǒng)適配,減少了柱外效應(yīng)。 與-HPLC聯(lián)用,分離了人尿中的苯(并)二氮和三環(huán)抗抑 郁劑(TCAs)。 管內(nèi)固相微萃取管內(nèi)固相微萃取(in-tube SPME) 將涂層涂在石英管的內(nèi)表面,可用GC開(kāi)管毛細(xì)管柱作為萃 取柱。用注射器吸入樣品,當(dāng)樣品中待測(cè)組份分配到毛細(xì) 管內(nèi)壁固定相上時(shí),將閥切換至采樣位置,以適當(dāng)溶劑解 吸,將解吸溶液轉(zhuǎn)移到樣品管中,再切至進(jìn)樣位置。 涂層方便易得,種類多樣,易于自動(dòng)化。 in

27、-tube SPME也可與毛細(xì)管LC聯(lián)用。30cm長(zhǎng),0.25 mm內(nèi) 徑,0.25 m膜厚的Omegawax 250 GC毛細(xì)管柱作為萃取 柱。分析柱(15cm0.3mm,填充3m C18 ) 。in-tube SPME與-HPLC聯(lián)用比與常規(guī)HPLC聯(lián)用的靈敏度高得多。 金屬絲管內(nèi)固相微萃取金屬絲管內(nèi)固相微萃取(Wire-in-tube SPME) 在in-tube SPME的萃取毛細(xì)管中插入一根不銹鋼絲, 毛細(xì)管的內(nèi)體積顯著減少。用這種結(jié)構(gòu)可以獲得更有 效的萃取42-43。 在一根長(zhǎng)20cm,內(nèi)徑0.25 mm的DB-1聚二甲基硅氧烷 涂層毛細(xì)管中插入一根同樣長(zhǎng)度的內(nèi)徑為0.20mm的不

28、 銹鋼絲構(gòu)成萃取器件,與-HPLC聯(lián)用測(cè)定了人尿中的 抗抑郁藥物。該方法在體積不變的情況下,增大了萃 取接觸面積,提高了萃取效率和解吸效率。 纖維管內(nèi)固相微萃取纖維管內(nèi)固相微萃取(Fiber-in-tube SPE-HPLC) 用聚合物細(xì)絲作萃取介質(zhì),幾百根聚合物細(xì)絲縱向填進(jìn)一 個(gè)短的聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯(PTFE)毛細(xì)管中。 相對(duì)于開(kāi)管式in-tube SPME技術(shù),由于增大了萃取接觸面, 萃取率明顯提高。 在細(xì)絲表面涂覆聚合物涂層可以提高萃取效率。如在細(xì)絲 表面涂覆苯基(5%)/甲基(95%)聚硅氧烷,萃取二己基鄰 苯二甲酸酯(DHP)、二-2-乙基-己基鄰苯二甲酸酯(DEHP) 和二辛基鄰苯二甲酸酯(DOP) 的萃取效率比沒(méi)有涂層時(shí)高 得多。 6.8 6.8 超臨界流體萃取超臨界流體萃取 ( (S Supercrtical upercrtical F Fluid luid E Extraction, xtraction, SFESFE) ) 以超臨界流體作流動(dòng)相,直接從固體(粉末)或液體 樣品中萃取目標(biāo)物質(zhì)(有機(jī)物)。 100年前人們就知道超臨界流體可以溶解很多物質(zhì)。 20世紀(jì)50年代,美國(guó)將SFE用于工業(yè)分離。 1963年,德國(guó)首次申請(qǐng)SFE分離技術(shù)的專利。 20世紀(jì)8090年代成為熱門學(xué)科。

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