病毒感染的檢測(cè)方法與防治原則

1、 病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢查方法病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢查方法 直接病毒診斷 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定 病毒感染的血清學(xué)診斷1.直接病毒診斷：直接病毒診斷： 細(xì)胞病理學(xué)方法細(xì)胞病理學(xué)方法:光鏡光鏡下檢查病變組織或脫落細(xì)胞中的特異性病毒下檢查病變組織或脫落細(xì)胞中的特異性病毒 包涵體包涵體，DNA病毒在核內(nèi)裝配產(chǎn)生核內(nèi)包涵體，病毒在核內(nèi)裝配產(chǎn)生核內(nèi)包涵體， RNA病毒在胞漿裝配產(chǎn)生胞漿包涵體病毒在胞漿裝配產(chǎn)生胞漿包涵體 電子顯微鏡法電子顯微鏡法:負(fù)染法（重金屬染液，電子光束通過(guò)低電子密負(fù)染法（重金屬染液，電子光束通過(guò)低電子密度的病毒顆粒但不能通過(guò)金屬背景，病毒顆粒明亮清晰，負(fù)反度的病毒顆粒但不能通過(guò)金屬背景，病毒

2、顆粒明亮清晰，負(fù)反差）、超薄切片法、差）、超薄切片法、immune electron microscope（抗體處理病毒（抗體處理病毒顆粒形成病毒抗體復(fù)合物凝聚成團(tuán)，高速離心負(fù)染后觀察）顆粒形成病毒抗體復(fù)合物凝聚成團(tuán)，高速離心負(fù)染后觀察） 病毒抗原檢測(cè)病毒抗原檢測(cè):胞內(nèi)病毒抗原的檢測(cè)：胞內(nèi)病毒抗原的檢測(cè)：免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 、 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù) 胞外（游離）病毒抗原的檢測(cè)：胞外（游離）病毒抗原的檢測(cè)：ELISA 病毒核酸檢測(cè)：病毒核酸檢測(cè)：核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù) 斑點(diǎn)分子雜交法、斑點(diǎn)分子雜交法、Southern印跡法、印跡法、 原位分子雜交法、原位分子雜交法、Northern印跡法

3、印跡法 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）（1）標(biāo)本處理：）標(biāo)本處理：組織、細(xì)胞：組織、細(xì)胞：粗提將沉渣、細(xì)菌、真菌等去除，釋粗提將沉渣、細(xì)菌、真菌等去除，釋 放病毒，有的還需要提純濃縮放病毒，有的還需要提純濃縮體液：體液：腦脊液、胸腔液、水泡液、尿液等直接接種培腦脊液、胸腔液、水泡液、尿液等直接接種培 養(yǎng)管養(yǎng)管拭子：拭子：咽、眼、鼻拭子直接放入含有抗生素的培養(yǎng)管咽、眼、鼻拭子直接放入含有抗生素的培養(yǎng)管 2.病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的分離培養(yǎng)與鑒定1 動(dòng)物接種動(dòng)物接種2 雞胚接種雞胚接種 雞胚對(duì)多種病毒敏感，羊膜腔、尿囊腔、雞胚對(duì)多種病毒敏感，羊膜腔、尿囊腔、 卵黃囊、絨毛尿囊膜卵黃

4、囊、絨毛尿囊膜3 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng) 傳110代二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳50100代傳代細(xì)胞培養(yǎng)三大培養(yǎng)方法三大培養(yǎng)方法（2）分離培養(yǎng)方法）分離培養(yǎng)方法器官培養(yǎng)組織培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 常用的細(xì)胞培養(yǎng)常用的細(xì)胞培養(yǎng)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指標(biāo)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指標(biāo)正常細(xì)胞正常細(xì)胞病變細(xì)胞病變細(xì)胞（3）病毒的鑒定）病毒的鑒定流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后胞后2448小時(shí)，在細(xì)胞膜上出小時(shí)，在細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附動(dòng)物及現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附動(dòng)物及人的紅細(xì)胞人的紅細(xì)胞 病毒感染雞胚、動(dòng)物或細(xì)胞后，引起病毒感染雞胚、動(dòng)物或細(xì)胞后，引起 50% 發(fā)生死發(fā)生死亡或病變的最小

5、病毒量亡或病變的最小病毒量 病毒樣本作病毒樣本作10倍連續(xù)稀釋倍連續(xù)稀釋 病毒感染單層細(xì)胞后，產(chǎn)生的局限性病灶（瓊脂限制病毒感染單層細(xì)胞后，產(chǎn)生的局限性病灶（瓊脂限制病毒的擴(kuò)散），稱蝕斑。一個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒體病毒的擴(kuò)散），稱蝕斑。一個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒體復(fù)制增殖后形成的，稱蝕斑形成單位（復(fù)制增殖后形成的，稱蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU），病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕），病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕斑形成單位來(lái)表示斑形成單位來(lái)表示 病毒的血清學(xué)診斷病毒的血清學(xué)診斷 最有特異性最有特異性中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)

6、血凝抑制試驗(yàn)免疫擴(kuò)散等免疫擴(kuò)散等免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)流感病毒與患者血清中抗流感病毒與患者血清中抗HA抗體（中和抗體）結(jié)合抗體（中和抗體）結(jié)合后，紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體就不能與后，紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體就不能與HA結(jié)合，血結(jié)合，血凝現(xiàn)象被抑制。雙份血清同時(shí)做血凝抑制試驗(yàn)，恢復(fù)凝現(xiàn)象被抑制。雙份血清同時(shí)做血凝抑制試驗(yàn)，恢復(fù)期抗體效價(jià)比急性期高期抗體效價(jià)比急性期高4倍或以上可確診倍或以上可確診Diagnosis Strategy for Viral Infection ELISA for HIV antibody 1、人工被動(dòng)免疫、人工被動(dòng)免疫（1）天然被動(dòng)免疫：通過(guò)胎盤的）天然被動(dòng)免疫：通過(guò)胎

7、盤的IgG和初乳中的和初乳中的IgA；（2）人工被動(dòng)免疫：）人工被動(dòng)免疫： 1）人胎盤或人血中提取出的免疫球蛋（）人胎盤或人血中提取出的免疫球蛋（IgG）；）； 2）康復(fù)期病人的血清或高效價(jià)免疫血清（）康復(fù)期病人的血清或高效價(jià)免疫血清（SARS 病人恢復(fù)期血清）病人恢復(fù)期血清）病毒感染的防治病毒感染的防治人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫滅活疫苗：滅活疫苗：乙腦疫苗乙腦疫苗 狂犬病疫苗狂犬病疫苗 流感滅活疫苗流感滅活疫苗HAV，HBV疫苗等疫苗等減毒活疫苗：減毒活疫苗：脊髓灰質(zhì)炎疫苗脊髓灰質(zhì)炎疫苗麻疹疫苗麻疹疫苗腮腺炎疫苗腮腺炎疫苗風(fēng)疹疫苗風(fēng)疹疫苗HAV疫苗疫苗亞單位疫苗：亞單位疫苗：流感疫苗、乙肝疫苗

8、流感疫苗、乙肝疫苗人工主動(dòng)免疫病毒疫苗 減毒活疫苗（減毒活疫苗（attenuated live vaccine） 滅活疫苗（滅活疫苗（inactivated vaccine） 亞單位疫苗（亞單位疫苗（subunit vaccine） 基因工程疫苗（基因工程疫苗（gene engineered vaccine） 基因工程亞單位疫苗（基因工程亞單位疫苗（gene engineered subunit vaccine） 基因工程載體疫苗（基因工程載體疫苗（gene engineered vectored vaccine） 基因缺失活疫苗（基因缺失活疫苗（gene deleted live vacci

9、ne） 核酸疫苗（核酸疫苗（nucleic acid vaccine）。）。 合成肽疫苗（合成肽疫苗（synthetic peptide vaccine） 抗獨(dú)特型抗體疫苗（抗獨(dú)特型抗體疫苗（anti-idiotype vaccine）活疫苗（live vaccine） 減毒活疫苗減毒活疫苗 基于基因工程技術(shù)的新型活疫苗基于基因工程技術(shù)的新型活疫苗 遺傳重組活疫苗遺傳重組活疫苗 基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗 載體活疫苗載體活疫苗減毒活疫苗(attenuated live vaccine) 自然或人工選擇法（如自然或人工選擇法（如Ts株）株） 所篩選的對(duì)人低毒所篩選的對(duì)人低毒或無(wú)毒的變異株，如脊

10、灰、流感、麻疹的減毒株或無(wú)毒的變異株，如脊灰、流感、麻疹的減毒株 優(yōu)點(diǎn)：模擬自然感染，免疫效果好，局部?jī)?yōu)點(diǎn)：模擬自然感染，免疫效果好，局部IgA。 理論上的缺點(diǎn)，實(shí)際工作中少見理論上的缺點(diǎn)，實(shí)際工作中少見 變異株可能回復(fù)到有毒力的野生株變異株可能回復(fù)到有毒力的野生株 如果機(jī)體免疫缺陷，減毒株仍可能引起感染或并發(fā)癥如果機(jī)體免疫缺陷，減毒株仍可能引起感染或并發(fā)癥 可能激活機(jī)體內(nèi)其它病毒的感染可能激活機(jī)體內(nèi)其它病毒的感染 減毒活苗可能引起持續(xù)感染減毒活苗可能引起持續(xù)感染 成功的范例：成功的范例：1961年我國(guó)應(yīng)用脊灰疫苗，脊灰發(fā)年我國(guó)應(yīng)用脊灰疫苗，脊灰發(fā)病率大幅度下降。病率大幅度下降。1980年天花

11、病毒滅絕年天花病毒滅絕遺傳重組活疫苗 將野毒株表面抗原基因與弱毒株其他基將野毒株表面抗原基因與弱毒株其他基因組合而獲得減毒活病毒因組合而獲得減毒活病毒 適用于基因組分節(jié)段雙鏈適用于基因組分節(jié)段雙鏈RNA病毒，如病毒，如流感病毒、輪狀病毒等流感病毒、輪狀病毒等基因缺失活疫苗 利用利用DNA重組技術(shù)，定向缺失病毒基重組技術(shù)，定向缺失病毒基因組的某一區(qū)段，使病毒喪失毒力而因組的某一區(qū)段，使病毒喪失毒力而保留增殖能力和免疫原性保留增殖能力和免疫原性 優(yōu)點(diǎn)：疫苗株的遺傳背景清楚，不易優(yōu)點(diǎn)：疫苗株的遺傳背景清楚，不易突變回到野毒株突變回到野毒株載體活疫苗 利用利用DNA重組技術(shù)，將編碼病毒抗原的重組技術(shù)，

12、將編碼病毒抗原的基因插入到另一無(wú)毒力的載體病毒，使基因插入到另一無(wú)毒力的載體病毒，使之高效表達(dá)之高效表達(dá) 易建立多價(jià)疫苗易建立多價(jià)疫苗 載體病毒常用的有痘苗病毒、腺病毒、載體病毒常用的有痘苗病毒、腺病毒、HSV-1滅活疫菌（inactivated vaccine） 滅活全病毒疫苗滅活全病毒疫苗 亞單位疫苗亞單位疫苗 合成肽病毒疫苗合成肽病毒疫苗 基因工程疫苗基因工程疫苗 獨(dú)特型病毒疫苗獨(dú)特型病毒疫苗 核酸疫苗核酸疫苗滅活全病毒疫苗 物理或化學(xué)方法滅活病毒。適用物理或化學(xué)方法滅活病毒。適用烈性或易變異烈性或易變異病毒如乙腦病毒、狂犬病病毒、流感病毒，常病毒如乙腦病毒、狂犬病病毒、流感病毒，常用用

13、甲醛甲醛液作為滅活劑液作為滅活劑 優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)簡(jiǎn)單、易保存運(yùn)輸優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)簡(jiǎn)單、易保存運(yùn)輸 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 需要大量培養(yǎng)病毒，成本高需要大量培養(yǎng)病毒，成本高 無(wú)局部抗體，不激活無(wú)局部抗體，不激活CTL，可激活，可激活TDTH 甲醛滅活的麻疹病毒和甲醛滅活的麻疹病毒和RSV疫苗可加重疾病，機(jī)制疫苗可加重疾病，機(jī)制不詳不詳亞單位疫苗（subunit vaccine） 種類種類 化學(xué)方法制備：如化學(xué)方法制備：如HBsAg和流感和流感HA 基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 不含病毒核酸，僅有能誘導(dǎo)中和抗體的衣殼不含病毒核酸，僅有能誘導(dǎo)中和抗體的衣殼蛋白或包膜表面抗原。蛋白或包膜表面抗原。免除了回復(fù)

14、突變和交免除了回復(fù)突變和交叉復(fù)活的可能叉復(fù)活的可能 消除腫瘤病毒的潛在的致癌作用消除腫瘤病毒的潛在的致癌作用合成肽病毒疫苗 人工合成病毒保護(hù)性抗原決定簇肽段人工合成病毒保護(hù)性抗原決定簇肽段 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 制備容易，可大量生產(chǎn)，易保存，副作用少制備容易，可大量生產(chǎn)，易保存，副作用少 理論與實(shí)踐上的缺點(diǎn)理論與實(shí)踐上的缺點(diǎn) 合成肽不具有高級(jí)結(jié)構(gòu)，免疫原性弱，使用合成肽不具有高級(jí)結(jié)構(gòu)，免疫原性弱，使用時(shí)需要加佐劑。時(shí)需要加佐劑。 不同肽免疫活性有差異。不同肽免疫活性有差異。 部分肽只激發(fā)部分肽只激發(fā)B細(xì)胞表位，缺乏激發(fā)細(xì)胞表位，缺乏激發(fā)TH細(xì)胞細(xì)胞的表位的表位基因工程疫苗 利用利用DNA重組技術(shù)制備的生物

15、制品。如將編重組技術(shù)制備的生物制品。如將編碼病毒特異抗原的基因用適當(dāng)?shù)妮d體將此基碼病毒特異抗原的基因用適當(dāng)?shù)妮d體將此基因帶入大腸桿菌或真核細(xì)胞，使之表達(dá)并純因帶入大腸桿菌或真核細(xì)胞，使之表達(dá)并純化表達(dá)產(chǎn)物化表達(dá)產(chǎn)物 研發(fā)成本高，生產(chǎn)成本低，下游工程復(fù)雜研發(fā)成本高，生產(chǎn)成本低，下游工程復(fù)雜核酸疫苗 將病毒基因?qū)雽⒉《净驅(qū)隓NA載體（通常是帶有真載體（通常是帶有真核表達(dá)調(diào)控基因的質(zhì)粒或病毒），將重組核表達(dá)調(diào)控基因的質(zhì)粒或病毒），將重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物或人體，重組導(dǎo)入動(dòng)物或人體，重組DNA可以在細(xì)可以在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)出目的蛋白胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)出目的蛋白 優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)刺激產(chǎn)生體液和細(xì)

16、胞免疫，能優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)刺激產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，能誘導(dǎo)誘導(dǎo)CTL活性，易生產(chǎn)，易保存活性，易生產(chǎn)，易保存 理論上缺點(diǎn)：安全性尚待考察理論上缺點(diǎn)：安全性尚待考察 目前僅在實(shí)驗(yàn)研究中，尚未投放市場(chǎng)目前僅在實(shí)驗(yàn)研究中，尚未投放市場(chǎng)獨(dú)特型病毒疫苗（idiotype vaccine） 基于基于Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，內(nèi)影像組抗體中含有與抗的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，內(nèi)影像組抗體中含有與抗原一致的表位序列，又稱抗獨(dú)特型抗體疫苗。將病毒抗原一致的表位序列，又稱抗獨(dú)特型抗體疫苗。將病毒抗原接種動(dòng)物，產(chǎn)生原接種動(dòng)物，產(chǎn)生Ab1；Ab1接種另一動(dòng)物，產(chǎn)生接種另一動(dòng)物，產(chǎn)生Ab2； Ab2接種人產(chǎn)生接種人產(chǎn)生Ab3 Ab1與與Ab2互補(bǔ)，互補(bǔ)， Ab2與與Ab3互互補(bǔ)，補(bǔ)，Ab3在結(jié)構(gòu)上與在結(jié)構(gòu)上與Ab1相似，相似，