實(shí)驗(yàn)七DNA的瓊脂糖凝膠電泳教學(xué)教材

1、實(shí) 驗(yàn) 七DNA 的 瓊 脂糖凝膠電泳精品資料僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝2實(shí)驗(yàn)七DNA的瓊脂糖凝膠電泳（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康沫傊悄z電泳是常用的檢測(cè)核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，掌握有關(guān)的技術(shù)和識(shí)讀電泳圖 譜的方法。實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定 DNA、RNA分子混合物的方法， 這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和 分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身

2、的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的 DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形 DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子（ocDNA）、和線形DNA分子（IDNA）。這三種不同構(gòu)型 分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)椋篶ccDNA IDNA ocDNA核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中 只有一個(gè)磷酸解離，所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而 PH8.0-8.3時(shí), 堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極泳 動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，

3、因此對(duì)泳動(dòng)速度影響不大。在中性 或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長(zhǎng)的雙鏈DNA的泳動(dòng)率大致相同。影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是：1、樣品的物理性狀即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。一般而言，電荷密度愈大，泳 動(dòng)率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對(duì)泳動(dòng)率的影響不明 顯。對(duì)線形分子來說，分子量的常用對(duì)數(shù)與泳動(dòng)率成反比，用此標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳并測(cè) 精品資料僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝3定其泳動(dòng)率，然后進(jìn)行DNA分子長(zhǎng)度（bp）的負(fù)對(duì)數(shù)一一泳動(dòng)距離作標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖，可以用于測(cè)定未知分子的長(zhǎng)度大小。DNA分子的空間構(gòu)型對(duì)泳動(dòng)率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的大小順序 為：cDNA

4、 IDNA ocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和溴化 乙錠等的影響，會(huì)出現(xiàn)相反的情況。2、支持物介質(zhì)核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合 鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，是 于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr ）在N,N,N -四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長(zhǎng)鏈， 并通過交聯(lián)劑N,N-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小由 Acr 與Bis的相對(duì)比例決定。瓊脂糖凝膠適合分離長(zhǎng)度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于小片段（5bp-500bp）

5、的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍 的DNA分子。3、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而 減小，所以電泳時(shí)一般采用低電壓，不超過 4V/cm。而對(duì)于大片段電泳，甚至 用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進(jìn)行高壓電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。4、緩沖液離子強(qiáng)度核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。TAE價(jià)格 低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。 TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)， 會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用 TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價(jià)離子，抑制 DNase,保

6、護(hù)DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。精品資料僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝4核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一 種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復(fù)合物時(shí)，出現(xiàn)不同的效應(yīng)。254nm的紫外線照射時(shí)，靈敏度最高，但對(duì) DNA損傷 嚴(yán)重；360nm紫外線照射時(shí)，雖然靈敏度較低，但對(duì)DNA損傷小，所以適合對(duì)DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對(duì) DNA 損傷不是很大，所以也比較適用。使用溴化乙錠對(duì)DNA樣品進(jìn)行染色，可以在凝膠中加入終濃度為

7、 0.5卩g/m的 EB。EB摻入DNA分子中，可以在電泳過程中隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，但是 如果要測(cè)定核酸分子大小時(shí)，不宜使用以上方法，而是應(yīng)該在電泳結(jié)束后，把 凝膠浸泡在含0.5卩g/mlEB勺溶液中1030min進(jìn)行染色。BE見光分解，應(yīng)在 避光條件下4C保存。材料、試劑及器具1、材料 1kbMarker （分子量標(biāo)準(zhǔn)）；DNA樣品2、試劑加樣緩沖液（6x）: 0.25%溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）;酶 液（10mg/ml）。3、器具（1） 電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。（2） 紫外透射儀。操作步驟1、按所分離的DNA分子的大小范圍，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一

8、錐形瓶 中，加入適量的0.5河BE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透 明。稍搖勻，得膠液。冷卻至 60 E左右，在膠液內(nèi)加入適量的溴化乙錠至濃度 為 0.5 卩 g/ml精品資料僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝52、取有機(jī)玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴(yán)，并滴加少量的膠液封好 膠帶與膠槽之間的縫隙。3、 水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至 60C左右的膠 液，使之形成均勻水平的膠面。4、.待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電 泳槽內(nèi)。5、在槽內(nèi)加入0.5 XBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面&把待檢測(cè)的樣品，按以下量在潔凈

9、載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的 加樣孔中。1卩加樣緩沖液（6% +5卩待測(cè)DNA樣品+0.5卩1EB（ 10mg/ml）（注：若膠內(nèi)未加 EB，可選用此法）。7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過 5V/cm，開始電泳。點(diǎn)樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。8、 觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。當(dāng)其移動(dòng)至距膠板前沿約1cm處，可停 止電泳。9、染色：把膠槽取出，小心滑出膠塊，水平放置于一張保鮮膜或其他支持物 上，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約 30min。10、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠放在上面。關(guān)上樣品室

10、外門，打開紫外燈（360nm或254nm），通過觀察孔進(jìn)行觀察。注意事項(xiàng)1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，務(wù)必小心，勿 沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區(qū)域操作， 戴一次性手套，并及時(shí)更換。精品資料僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝62、預(yù)先加入EB時(shí)可能使DNA的泳動(dòng)速度下降15%左右，而且對(duì)不同構(gòu)型的 DNA的影響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用0.5卩g/m的 EB溶液浸泡染色。若膠內(nèi)或樣品內(nèi)已加 EB，染色步驟可省略；若 凝膠放置一段時(shí)間后才觀察，即使原來膠內(nèi)或樣品已加 EB，也建議增加此步。3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除，否則，需重新 制膠。4、以0.5 XBE作為電泳緩沖液時(shí)，溴酚蘭在 0.5%1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳 動(dòng)