《昆蟲桿狀病毒載體》演示PPT

1、 原核細(xì)胞系統(tǒng)原核細(xì)胞系統(tǒng) l大腸桿菌細(xì)胞大腸桿菌細(xì)胞 操作簡(jiǎn)便 周期短、收益大 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定 相對(duì)分子質(zhì)量有限 不能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一 些翻譯后加工 、修飾 體外基因體外基因 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) 真核細(xì)胞系統(tǒng)真核細(xì)胞系統(tǒng) l哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞 l酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞 l昆蟲細(xì)胞（昆蟲細(xì)胞（桿狀桿狀 病毒表達(dá)系統(tǒng)病毒表達(dá)系統(tǒng)） 獨(dú)特特性 高表達(dá)高表達(dá) 低成本低成本 安全性高安全性高 大規(guī)模生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn) 前言前言 v 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)真核表達(dá) 系統(tǒng)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白多角體蛋白的

2、的強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)構(gòu) 建的表達(dá)載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水建的表達(dá)載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水 平的表達(dá)。平的表達(dá)。 v 具有具有高效表達(dá)高效表達(dá)、基因克隆容量大基因克隆容量大、重組病毒易于篩選重組病毒易于篩選、安安 全性高全性高、且有完備的、且有完備的翻譯后加工修飾翻譯后加工修飾系統(tǒng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成系統(tǒng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成 為基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一。為基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一。 v 利用該表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白可用于藥物開發(fā)、疫苗生產(chǎn)、利用該表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白可用于藥物開發(fā)、疫苗生產(chǎn)、 生物殺蟲劑等多個(gè)領(lǐng)域。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，已有生物殺蟲劑等多個(gè)領(lǐng)域。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，已有100

3、0 余種外余種外 源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功地表達(dá)，其源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功地表達(dá)，其 中約有中約有95% 的外源重組蛋白能夠被正確的轉(zhuǎn)譯后加工修的外源重組蛋白能夠被正確的轉(zhuǎn)譯后加工修 飾，具有與天然蛋白相同的生物活性。飾，具有與天然蛋白相同的生物活性。 1.1 桿狀病毒載體桿狀病毒載體 1.2 昆蟲細(xì)胞宿主昆蟲細(xì)胞宿主 表達(dá)體系表達(dá)體系 表達(dá)過程表達(dá)過程 v將外源目的基因?qū)⑼庠茨康幕虿迦氩迦氲絾?dòng)子下游到啟動(dòng)子下游 v與桿狀病毒與桿狀病毒重組重組，獲得重組病毒，獲得重組病毒 v將重組的病毒將重組的病毒純化純化 v感染感染昆蟲細(xì)胞或蟲體昆蟲細(xì)胞或蟲體 v外源基

4、因隨著病毒的復(fù)制而獲得外源基因隨著病毒的復(fù)制而獲得表達(dá)表達(dá) v 1.1.1桿狀病毒簡(jiǎn)介桿狀病毒簡(jiǎn)介 v 桿狀病毒是研究細(xì)胞分子生物學(xué)的重要工具，同時(shí)也是外源基桿狀病毒是研究細(xì)胞分子生物學(xué)的重要工具，同時(shí)也是外源基 因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體。桿狀病毒只來源于因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體。桿狀病毒只來源于無脊椎動(dòng)物無脊椎動(dòng)物， 已發(fā)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)600多種多種桿狀病毒，其中僅有不到桿狀病毒，其中僅有不到20 種種進(jìn)行了分子生進(jìn)行了分子生 物學(xué)研究。物學(xué)研究。 v 桿狀病毒的基因組為單一桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈DNA 分子，分子， 大小為大小為 80 160kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)

5、制和轉(zhuǎn)錄。，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。DNA 復(fù)制后組裝在桿狀病毒的核衣內(nèi)，后者具有較大的柔韌性，可復(fù)制后組裝在桿狀病毒的核衣內(nèi)，后者具有較大的柔韌性，可 容納較大片段的外源容納較大片段的外源DNA 插入，因此是表達(dá)大片段插入，因此是表達(dá)大片段DNA 的理的理 想載體。其中想載體。其中, 用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限 于于核型多角體病毒核型多角體病毒( nuclear poly hedrosis virus, NPV) 。 v 現(xiàn)已知基因組全序列的桿狀病毒僅有現(xiàn)已知基因組全序列的桿狀病毒僅有7 種種: 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒苜蓿丫

6、紋夜蛾核型多角體病毒( AcMNPV ) ( AcMNPV ) 家蠶核多角體病毒家蠶核多角體病毒( BmNPV ) ( BmNPV ) 黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒( OpMNPV ) ( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒( LdMNPV ) ( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒( SeMNPV) ( SeMNPV) 棉鈴蟲核型多角體病毒棉鈴蟲核型多角體病毒( HaNPV) ( HaNPV) 斜紋夜蛾核型多角體病毒斜紋夜蛾核型多角體病毒( SpltMNPV) ( SpltMNPV) v

7、AcMNPV 是昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最常用的載體，基因表達(dá)分為是昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最常用的載體，基因表達(dá)分為4 個(gè)個(gè) 階段階段: 立即早期基因表達(dá)立即早期基因表達(dá)、早期基因表達(dá)早期基因表達(dá)、晚期基因表達(dá)晚期基因表達(dá)和和極晚期基因表極晚期基因表 達(dá)達(dá)。 早于早于DNA 復(fù)制復(fù)制 病毒病毒DNA 合成合成 v 多角體蛋白多角體蛋白是形成包含體的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá)是形成包含體的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá) 30% 50%，是病毒復(fù)制，是病毒復(fù)制非必需成分非必需成分，但對(duì)病毒粒子卻有，但對(duì)病毒粒子卻有保護(hù)作用保護(hù)作用， 可使之保持穩(wěn)定和感染能力。可使之保持穩(wěn)定和感染

8、能力。 v P10 蛋白蛋白為另一類高效表達(dá)的極晚期蛋白，也是一類病毒復(fù)制為另一類高效表達(dá)的極晚期蛋白，也是一類病毒復(fù)制非必需成非必需成 分分，可在細(xì)胞中形成纖維狀物質(zhì)，可能與，可在細(xì)胞中形成纖維狀物質(zhì)，可能與細(xì)胞溶解細(xì)胞溶解有關(guān)。有關(guān)。 理想的外源理想的外源 基因插入位基因插入位 點(diǎn)點(diǎn) v 載體重組原理：原理是人為將桿狀病毒多角體蛋白兩翼序列載體重組原理：原理是人為將桿狀病毒多角體蛋白兩翼序列 的同源序列引入含外源基因的質(zhì)粒載體中，通過同源重組方的同源序列引入含外源基因的質(zhì)粒載體中，通過同源重組方 式來實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)Σ《径嘟求w蛋白基因的替換。式來實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)Σ《径嘟求w蛋白基因的替換。 v

9、由于桿狀病毒分子質(zhì)量約為由于桿狀病毒分子質(zhì)量約為134kb，不能利用，不能利用多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) （酶切連接）進(jìn)行基因重組，只能利用桿狀病毒和帶有外源（酶切連接）進(jìn)行基因重組，只能利用桿狀病毒和帶有外源 基因的基因的質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體進(jìn)行進(jìn)行共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)移載體的介導(dǎo)）。（轉(zhuǎn)移載體的介導(dǎo)）。 多克隆位點(diǎn)：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別 位點(diǎn)。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。 共轉(zhuǎn)染：物理上不相連的基因被整合到同一整合序列并在同一轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 的現(xiàn)象。 1.1.2桿狀病毒載體的重組桿狀病毒載體的重組 v 將極晚期基因?qū)O晚期基因( 如多角體基因及其邊

10、界區(qū)如多角體基因及其邊界區(qū)) 克隆克隆入細(xì)菌的質(zhì)粒入細(xì)菌的質(zhì)粒 中中 v 消除消除其編碼區(qū)和不合適的酶切位點(diǎn)其編碼區(qū)和不合適的酶切位點(diǎn) v 保留保留其其5c端對(duì)高效表達(dá)必需的調(diào)控區(qū)端對(duì)高效表達(dá)必需的調(diào)控區(qū) v 在下游在下游引入引入合適的酶切位點(diǎn)供外源基因的插入，即得到合適的酶切位點(diǎn)供外源基因的插入，即得到轉(zhuǎn)移載轉(zhuǎn)移載 體體。 v 將要表達(dá)的外源基因?qū)⒁磉_(dá)的外源基因插入插入其啟動(dòng)子下游其啟動(dòng)子下游 v 與野生型與野生型AcNPV DNA 共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞昆蟲細(xì)胞 v 通過兩側(cè)同源邊界區(qū)在體內(nèi)發(fā)生通過兩側(cè)同源邊界區(qū)在體內(nèi)發(fā)生同源重組同源重組，使多角體蛋白基因，使多角體蛋白基因 被外源基因取代

11、。被外源基因取代。 1.1.3桿狀病毒載體的篩選桿狀病毒載體的篩選 v 由于由于多角體基因多角體基因被破壞，則不能形成多角體。這種表型在進(jìn)被破壞，則不能形成多角體。這種表型在進(jìn) 行常規(guī)行常規(guī)空斑測(cè)定空斑測(cè)定時(shí)，可同野生型具有多角體的病毒空斑區(qū)別時(shí)，可同野生型具有多角體的病毒空斑區(qū)別 開來，開來， 這就是最初的篩選重組病毒的方式。這就是最初的篩選重組病毒的方式。 v 由于重組效率較低由于重組效率較低( 0. 1% 1%) ，表型差別不顯著，應(yīng)，表型差別不顯著，應(yīng) 用上有一定的困難。用上有一定的困難。 1.1.3桿狀病毒載體的篩選桿狀病毒載體的篩選 v 為此，經(jīng)過不斷探索，在重組桿狀病毒的篩選與鑒

12、定方面取為此，經(jīng)過不斷探索，在重組桿狀病毒的篩選與鑒定方面取 得了很大改進(jìn)。得了很大改進(jìn)。 v 具體方法有以下幾種：具體方法有以下幾種： v -半乳糖苷酶的藍(lán)白篩選半乳糖苷酶的藍(lán)白篩選 v 體外酶促定位重組體外酶促定位重組 v Bacmid v TK 基因基因 v Neo 基因基因 v Luckow 等開發(fā)。快速、高效產(chǎn)生重組等開發(fā)?？焖?、高效產(chǎn)生重組AcMNPV 病毒。取病毒。取 桿狀病毒桿狀病毒( baculovirus) 和質(zhì)粒和質(zhì)粒( plasmid) 的英文字頭的英文字頭 字尾命名為字尾命名為Bacmid，即桿狀病毒質(zhì)粒之意。，即桿狀病毒質(zhì)粒之意。 v 根據(jù)根據(jù)F因子載體原理，用類似

13、于酵母體內(nèi)重組的方法，因子載體原理，用類似于酵母體內(nèi)重組的方法，構(gòu)建構(gòu)建了了 一種新桿狀病毒穿梭載體一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid。該載體可像質(zhì)粒一樣在。該載體可像質(zhì)粒一樣在 大腸桿菌中生長，又對(duì)鱗翅目昆蟲細(xì)胞具有感染性。大腸桿菌中生長，又對(duì)鱗翅目昆蟲細(xì)胞具有感染性。 v Bacmid 含有含有F因子復(fù)制子因子復(fù)制子( 可在大腸桿菌中復(fù)制可在大腸桿菌中復(fù)制) 、卡那、卡那 霉素抗性基因及霉素抗性基因及Tn7 轉(zhuǎn)座位點(diǎn)轉(zhuǎn)座位點(diǎn)attTn7。 v 轉(zhuǎn)移載體中，外源基因轉(zhuǎn)移載體中，外源基因置于置于桿狀病毒啟動(dòng)子之下桿狀病毒啟動(dòng)子之下, 兩端分別為兩端分別為 Tn7的左右端。以其的左右端。以其轉(zhuǎn)化

14、轉(zhuǎn)化含含Bacmid的的E.coli菌株，由輔助菌株，由輔助 質(zhì)粒提供反式作用發(fā)生質(zhì)粒提供反式作用發(fā)生轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座，而將外源基因轉(zhuǎn)到，而將外源基因轉(zhuǎn)到Bacmid的的 attTn7位置。位置。 v在在Bacmid 中，外源基因被核多角體啟動(dòng)子控制，中，外源基因被核多角體啟動(dòng)子控制， 并包含了多種抗性基因及并包含了多種抗性基因及LacZ 缺失標(biāo)記，極大地缺失標(biāo)記，極大地 方便了重組病毒的篩選及鑒定。這種重組了外源基方便了重組病毒的篩選及鑒定。這種重組了外源基 因的因的Bacmid轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞，可得到轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞，可得到100%陽性陽性 重組病毒重組病毒 。 v操作簡(jiǎn)單方便，只需操作簡(jiǎn)單方便，只需

15、1 周即可完成重組病毒載體的周即可完成重組病毒載體的 構(gòu)建。構(gòu)建。 v 由于我國有養(yǎng)蠶業(yè)，還可在由于我國有養(yǎng)蠶業(yè)，還可在AcMNPV Bac-to-Bac表達(dá)系表達(dá)系 統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，構(gòu)建能夠應(yīng)用于家蠶的統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，構(gòu)建能夠應(yīng)用于家蠶的BmNPV Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)，這將大大減少傳統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，這將大大減少傳統(tǒng)昆蟲桿狀病毒 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源重組蛋白所需時(shí)間，極大地提高了工作效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源重組蛋白所需時(shí)間，極大地提高了工作效 率。還能夠解決培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞成本高，難于規(guī)?；a(chǎn)等問率。還能夠解決培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞成本高，難于規(guī)?；a(chǎn)等問 題。題。 v 重組率重組率1

16、00%、操作簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)便、1 周完成重組、全部操作都在周完成重組、全部操作都在 細(xì)菌中進(jìn)行，取名為細(xì)菌中進(jìn)行，取名為Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) 1.2 昆蟲細(xì)胞宿主昆蟲細(xì)胞宿主 v 昆蟲細(xì)胞在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中被作為非常重要的昆蟲細(xì)胞在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中被作為非常重要的 研究工具。研究工具。 v 目前全世界建立的昆蟲細(xì)胞系有目前全世界建立的昆蟲細(xì)胞系有800 多株，分別來源于鱗翅多株，分別來源于鱗翅 目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目、同翅目和目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目、同翅目和 半翅目半翅目8 個(gè)目的個(gè)目的170 余種昆蟲，其中具有實(shí)際應(yīng)

17、用的細(xì)胞系余種昆蟲，其中具有實(shí)際應(yīng)用的細(xì)胞系 大部分來自大部分來自鱗翅目鱗翅目和和雙翅目雙翅目。 v 以昆蟲桿狀病毒為載體的昆蟲細(xì)胞可成功、高效地表達(dá)外源以昆蟲桿狀病毒為載體的昆蟲細(xì)胞可成功、高效地表達(dá)外源 基因，生產(chǎn)具有重要藥用價(jià)值和具備天然活性的重組蛋白?；?，生產(chǎn)具有重要藥用價(jià)值和具備天然活性的重組蛋白。 因此，在眾多昆蟲細(xì)胞系中因此，在眾多昆蟲細(xì)胞系中鱗翅目鱗翅目昆蟲細(xì)胞系應(yīng)用最為廣泛。昆蟲細(xì)胞系應(yīng)用最為廣泛。 1.2 昆蟲細(xì)胞宿主昆蟲細(xì)胞宿主 v 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)既可在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)既可在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中，又可在中，又可在昆蟲昆蟲 和蛹和蛹內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。究竟在昆蟲體

18、內(nèi)還是在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)外內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。究竟在昆蟲體內(nèi)還是在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)外 源基因，可根據(jù)外源蛋白的性質(zhì)及其用途、表達(dá)水平高低、源基因，可根據(jù)外源蛋白的性質(zhì)及其用途、表達(dá)水平高低、 分離純化難易、純化要求高低等因素來考慮。分離純化難易、純化要求高低等因素來考慮。 v 然而，對(duì)于常規(guī)然而，對(duì)于常規(guī)小量小量及及高純度高純度的蛋白質(zhì)生產(chǎn)而言，利用的蛋白質(zhì)生產(chǎn)而言，利用體外體外 培養(yǎng)培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞來進(jìn)行表達(dá)是首選途徑。的昆蟲細(xì)胞來進(jìn)行表達(dá)是首選途徑。 v 相對(duì)于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細(xì)胞系的廣泛用途來說，相對(duì)于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細(xì)胞系的廣泛用途來說， 已經(jīng)建立的細(xì)胞系還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，仍需建立更多

19、的昆蟲細(xì)胞系已經(jīng)建立的細(xì)胞系還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，仍需建立更多的昆蟲細(xì)胞系 以滿足實(shí)際需要。以滿足實(shí)際需要。 安全性高安全性高 基因容量大基因容量大 表達(dá)水平高表達(dá)水平高 能進(jìn)行翻譯后的加工修飾能進(jìn)行翻譯后的加工修飾 重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能 相對(duì)其他表達(dá)系統(tǒng)它具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn)：相對(duì)其他表達(dá)系統(tǒng)它具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn)： 重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可為高：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可為高 表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚 物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達(dá)

20、產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近 天然蛋白。天然蛋白。 利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)富含二硫鍵的一些具有神經(jīng) 毒性的生物毒素肽將是一個(gè)最佳的選擇。 能進(jìn)行翻譯后的加工修飾能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)蛋白質(zhì)：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)蛋白質(zhì) 完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘?hào)完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、?；?、信號(hào) 肽切除及肽段的切割和分解等，修飾的位點(diǎn)與天然蛋白在細(xì)胞肽切除及肽段的切割和分解等，修飾的位點(diǎn)與天然蛋白在細(xì)胞 內(nèi)的情況完全一致。內(nèi)的情況完全一致。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明，在昆蟲細(xì)胞發(fā)生的糖基化位點(diǎn)與

21、哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中完全一致，但修飾的寡糖種類卻不完全一樣。這種不一致對(duì) 不同目的蛋白的活性影響不同，所以昆蟲表達(dá)系統(tǒng)還可作為一 個(gè)研究糖基化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能影響方面的理想模型。 表達(dá)水平高表達(dá)水平高：與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特：與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特 點(diǎn)就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可使目的蛋白的量達(dá)點(diǎn)就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可使目的蛋白的量達(dá) 到細(xì)胞總蛋白的到細(xì)胞總蛋白的50。 雖然目前科研工作者大都是在細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行表達(dá)外源基因，當(dāng)條件成熟時(shí)需要 大量制備某類外源蛋白時(shí)，最好采用昆蟲幼蟲或蛹。因?yàn)榕囵B(yǎng)昆蟲幼蟲和蛹遠(yuǎn)比培養(yǎng) 細(xì)胞簡(jiǎn)單、

22、廉價(jià)，而且利用昆蟲幼蟲或蛹能夠顯著提高外源基因的表達(dá)水平。 利用BmNPV 載體在家蠶幼蟲中成功表達(dá)出重組蜘蛛牽引絲蛋白，表達(dá)量高達(dá)每個(gè)昆 蟲活體6mg。一般在幼蟲體內(nèi)的淋巴液中，蛋白質(zhì)表達(dá)量較在細(xì)胞培養(yǎng)基中高10倍以 上。因此，通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可利用昆蟲活體大規(guī)模生產(chǎn)各種重組蛋白。 基因容量大基因容量大：昆蟲桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈：昆蟲桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈 DNA分子，大小為分子，大小為80 200kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核中，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核中 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。DNA 復(fù)制后組裝在桿狀病毒的毒粒內(nèi)，由于毒粒復(fù)制后組裝在桿狀病毒的毒粒內(nèi)，由于

23、毒粒 具有較大的柔韌性，能包裝較大的基因片段，可表達(dá)非常大具有較大的柔韌性，能包裝較大的基因片段，可表達(dá)非常大 ( 100kb) 的外源性基因。因此是表達(dá)大片段的外源性基因。因此是表達(dá)大片段DNA 的理想載體。的理想載體。 但目前尚無實(shí)驗(yàn)得知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。但目前尚無實(shí)驗(yàn)得知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。 我們感興趣的另外一個(gè)特點(diǎn)是在昆蟲桿狀病毒載體內(nèi)還可多基因 同時(shí)表達(dá)，具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因 的能力。根據(jù)設(shè)計(jì)需要既可采用不同的重組桿狀病毒同時(shí)感染細(xì) 胞的形式，也可在同一桿狀病毒載體上同時(shí)克隆多個(gè)外源基因， 其表達(dá)產(chǎn)物之間可有蛋白質(zhì)的相互

24、作用或加工形成具有活性的異 源二聚體或多聚體。 安全性高安全性高：由于桿狀病毒的天然宿主是昆蟲，不能在哺乳動(dòng)物：由于桿狀病毒的天然宿主是昆蟲，不能在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制病毒DNA 以及增殖病毒，桿狀病毒不會(huì)感染人。因以及增殖病毒，桿狀病毒不會(huì)感染人。因 此對(duì)細(xì)胞的生理影響較哺乳類病毒載體要小，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作者的此對(duì)細(xì)胞的生理影響較哺乳類病毒載體要小，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作者的 自身安全也比較有保障。自身安全也比較有保障。 現(xiàn)有研究也表明其啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒有活性，因此在表 達(dá)癌基因或有潛在毒性的蛋白質(zhì)時(shí)可能優(yōu)于其他表達(dá)系統(tǒng)。最新 研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV 病毒作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體

25、，也 可以將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物的細(xì)胞，如人的肝細(xì)胞。這意味 AcMNPV 病毒可能成為哺乳動(dòng)物基因治療的媒介體，因此桿狀 病毒有望在未來人類的基因治療中得到應(yīng)用。 v 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)、重組病毒殺蟲劑等昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)、重組病毒殺蟲劑等 眾多領(lǐng)域中。其中，在生物分子研究中，具有代表性的是重組蛋白的表達(dá)，眾多領(lǐng)域中。其中，在生物分子研究中，具有代表性的是重組蛋白的表達(dá)， 是目前桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最多的領(lǐng)域。成功表達(dá)出具有藥用價(jià)值的蛋白是目前桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最多的領(lǐng)域。成功表達(dá)出具有藥用價(jià)值的蛋白 質(zhì)又可用于藥物研發(fā)和疫苗生產(chǎn)

26、。質(zhì)又可用于藥物研發(fā)和疫苗生產(chǎn)。 v 功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)（functional genomics）的重要內(nèi)容是研究）的重要內(nèi)容是研究 基因組內(nèi)各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和核基因組內(nèi)各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和核 酸之間的相互關(guān)系。酸之間的相互關(guān)系。 v 實(shí)現(xiàn)這一計(jì)劃的前提是要生產(chǎn)幾萬種蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)這一計(jì)劃的前提是要生產(chǎn)幾萬種蛋白質(zhì) ，這就要求蛋白質(zhì)，這就要求蛋白質(zhì) 表達(dá)系統(tǒng)提供新的技術(shù)，諸如：通過簡(jiǎn)單的操作，生產(chǎn)各種活性表達(dá)系統(tǒng)提供新的技術(shù)，諸如：通過簡(jiǎn)單的操作，生產(chǎn)各種活性 形式的蛋白質(zhì)簡(jiǎn)化操作過程，縮短從基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)的時(shí)間以簡(jiǎn)形式的蛋白質(zhì)簡(jiǎn)化操作過

27、程，縮短從基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)的時(shí)間以簡(jiǎn) 便的操作，同時(shí)生產(chǎn)許多種蛋白質(zhì)。便的操作，同時(shí)生產(chǎn)許多種蛋白質(zhì)。 v 最新的研究和技術(shù)發(fā)展業(yè)已表明，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是解決最新的研究和技術(shù)發(fā)展業(yè)已表明，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是解決 上述問題的優(yōu)良系統(tǒng)，以昆蟲蟲體為宿主是十分有魅力的。上述問題的優(yōu)良系統(tǒng)，以昆蟲蟲體為宿主是十分有魅力的。 v 日本片倉公司在這方面進(jìn)行了卓有成效的探索導(dǎo)入Invitrogen公司的GATEWAY系統(tǒng) ， 利用Bac-to-Bac系統(tǒng)的載體，通過單一的LR Clonase就能同時(shí)構(gòu)建各種帶目的基因 的BEVS質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體；用缺失增殖所必須的線型化病毒DNA、含缺失增殖所必需基 因

28、的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體和外源基因同時(shí)感染蠶蛹，通過此法，不用篩選就能在短期內(nèi)獲得 正確的重組病毒和目的蛋白，由于使用的是蠶蛹，這種技術(shù)還可以自動(dòng)化操作。 v 由由BEVS生產(chǎn)的疫苗研究早已開始，生產(chǎn)的疫苗研究早已開始，HIV疫苗于疫苗于20世紀(jì)世紀(jì)80年年 代代 ,瘧疾疫苗于瘧疾疫苗于90年代進(jìn)人臨床年代進(jìn)人臨床 ,但由于這但由于這2種疾病的特殊性，種疾病的特殊性， 所有其他來源的疫苗都缺乏良好保護(hù)性，所以未能被使用。所有其他來源的疫苗都缺乏良好保護(hù)性，所以未能被使用。 v 盡管如此，臨床試驗(yàn)亦證明了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來源的重組盡管如此，臨床試驗(yàn)亦證明了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來源的重組 蛋白對(duì)人是安全

29、的。由家蠶宿主昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組多膚蛋白對(duì)人是安全的。由家蠶宿主昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組多膚 藥物國內(nèi)外尚無產(chǎn)品，其主要障礙在于這是一個(gè)新的宿主系統(tǒng)，藥物國內(nèi)外尚無產(chǎn)品，其主要障礙在于這是一個(gè)新的宿主系統(tǒng)， 且發(fā)達(dá)國家無養(yǎng)蠶業(yè)。國內(nèi)口服重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)多膚且發(fā)達(dá)國家無養(yǎng)蠶業(yè)。國內(nèi)口服重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)多膚 藥物已有開發(fā)，正進(jìn)人藥物審批階段，相信昆蟲桿狀病毒表達(dá)系藥物已有開發(fā)，正進(jìn)人藥物審批階段，相信昆蟲桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)重組多膚生產(chǎn)醫(yī)用藥物會(huì)有較好的前景。統(tǒng)重組多膚生產(chǎn)醫(yī)用藥物會(huì)有較好的前景。 v 在眾多應(yīng)用中，重組病毒殺蟲劑作為一類重要的具有開發(fā)潛力的在眾多應(yīng)用中，重組病毒殺蟲劑作為一類重要的具有開發(fā)潛力的 生物殺蟲劑，將是未來最容易產(chǎn)業(yè)化的一條成功之路。生物殺蟲劑，將是未來最容易產(chǎn)業(yè)化的一條成功之路。 v 昆蟲桿狀病毒具有宿主專一、致病力強(qiáng)、傳播快、無殘留、無抗昆蟲桿狀病毒具有宿主專一、致病力強(qiáng)、傳播快、無殘留、無抗 藥性、對(duì)脊椎動(dòng)物和植物安全、不易引起廣泛規(guī)模的生態(tài)平衡的藥性、對(duì)