第一章酶ppt課件

1、第一章第一章 酶酶 目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶t4 dna連接酶連接酶15c重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶工具酶工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 dna聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 t4dna連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 taq dna聚合酶聚合酶重組重組dna技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割dnadna連接酶連接酶催化催化dna中相鄰的中相鄰的5

2、 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使dna切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)dna分子或片段連接分子或片段連接dna聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cdna分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針dna序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端klenow片段片段又名又名dna聚合酶聚合酶i大片段，具有完整大片段，具有完整dna聚合酶聚合酶i的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cdna第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈dna 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成

3、cdna替代替代dna聚合酶聚合酶i進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或dna序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction (restriction endonucleaseendonuclease) )這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶識(shí)別識(shí)別dna的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其并

4、在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈周圍切割雙鏈dna的一類核酸內(nèi)切酶。的一類核酸內(nèi)切酶。ggatcccctagggcctaggatcc gbam h（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（三）（三）ii型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（四）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（四）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源的一類酶，其

5、功能是避免外源源的一類酶，其功能是避免外源的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。機(jī)制。寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction）與修飾）與修飾 (modification) (modification) 現(xiàn)象：現(xiàn)象： 人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（修飾現(xiàn)象簡稱（r/mr/m體系）。體系）。由寄主控制由寄主控制 r/mr/m體系：體系： 寄主是由兩種酶活性配合完成的寄主是由兩種酶

6、活性配合完成的 一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶 另一種是核酸內(nèi)切限制酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶 e. e.colicolib b含有含有ecobecob核酸酶和核酸酶和ecobecob甲基化酶甲基化酶 當(dāng)當(dāng)(k)(k)噬菌體侵染噬菌體侵染e. e.colicolib b時(shí)，由于時(shí)，由于其其dnadna中有中有ecobecob核酸酶特異識(shí)別的堿基核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而序列，被降解掉。而e. e.colicolib b的的dnadna中雖中雖然也存在這種特異序列，但可在然也存在這種特異序列，但可在ecobecob甲甲基化酶的作用下，催化基化酶的作用下，催化s- s-腺苷

7、甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸（samsam）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。的特定堿基，使之甲基化。 ecobecob核酸酶核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。不能識(shí)別已甲基化的序列。r/mr/m體系的作用：類似于免疫系統(tǒng)體系的作用：類似于免疫系統(tǒng) 保護(hù)自身的保護(hù)自身的dnadna不受限制；不受限制； 破壞外源破壞外源dnadna使之迅速降解使之迅速降解由于由于r/mr/m現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。基因工程重要的工具酶。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切

8、根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶割的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：分為三類： 型酶、型酶、型酶、型酶、 型酶型酶（基基因工程技術(shù)中常用的是因工程技術(shù)中常用的是類類）i類 能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近切割雙鏈，但切割序列沒有專一性。ii類 識(shí)別位點(diǎn)（回文序列）嚴(yán)格專一，并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)將雙鏈切斷。 iii類 識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一（不是回文序列），但切點(diǎn)不專一，往往不在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部。因此在基因工程中具有實(shí)用價(jià)值的是ii類限制性內(nèi)切酶。 型酶：型酶： 19681968年，年，m.meselsonm.meselson和和r.yuanr.yuan在在e. e.col

9、icolib b和和e. e.colicolik k中分離出的核酸內(nèi)切酶。中分離出的核酸內(nèi)切酶。 分子量較大，反應(yīng)需分子量較大，反應(yīng)需mgmg+、s- s-腺苷酰腺苷酰-l-l-甲硫甲硫氨酸（氨酸（samsam）、）、atpatp等。這類酶有特異的識(shí)別等。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)沒有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。 型酶型酶 19701970年，年，h.o.smithh.o.smith和和k.w.wilcoxk.w.wilcox在流感嗜在流感嗜血血rdrd株中分離出來的限制酶。株中分離出來的限制酶

10、。 分子量較?。ǚ肿恿枯^?。?0105 5dada），只有一種多肽，），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需mgmg+的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。 識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。 許多許多型酶切割后，可在上形型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重組。成粘性末端，有利于片段的重組。 型酶型酶 這類酶可識(shí)別特定堿基順序，并這類酶可

11、識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的在這一順序的3 3端端2426bp2426bp處切開處切開，所以它的切割位點(diǎn)也是沒，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。有特異性的。 限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性 i 型 ii 型 iii 型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子atp mg2+ samatp mg2+ sammg2+識(shí)別序列tgan8tgct旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列g(shù)agccaacn6gtgccagcag切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處a. a.限制酶識(shí)別靶序列同限制酶識(shí)別靶序列同dnadna的來源無關(guān)；的來源無

12、關(guān)；（三）（三）ii型限制性核酸內(nèi)切酶的基型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性本特性a. a. 識(shí)別位點(diǎn)的特異性識(shí)別位點(diǎn)的特異性識(shí)別靶序列是唯一的，通識(shí)別靶序列是唯一的，通常是由常是由48個(gè)核苷個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。酸組成的特定序列（靶序列）。b. 識(shí)別序列的對(duì)稱性識(shí)別序列的對(duì)稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，以以中軸線雙側(cè)的中軸線雙側(cè)的dna上堿基呈反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列上堿基呈反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 如：如：gaa ttc ccc ggg ctt aag ggg cccc. 大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)

13、別序列內(nèi)部或兩側(cè)pst iprovindencia stuartii 164 ctgcaggacgtchaemophilus influenzae rd d. d. 核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式粘性末端粘性末端 ：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的具有粘性末端的dnadna片斷。片斷。平末端平末端 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的這樣形式的斷裂是形

14、成具有平末端的dnadna片斷。不片斷。不易重新環(huán)化。易重新環(huán)化。 bam hgtccaggcctaggatcc gggatcccctagghindgtcgaccagctggacctg平端切口平端切口粘端切口粘端切口 ecori等產(chǎn)生的5粘性末端5 g-c-t-g-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-g-c-t-c 5ecori 37 5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c 5 退火 4-7 5 g-c-t-g a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a

15、-a g-c-t-c 5oh pohp同裂酶（同裂酶（isoschizomers) isoschizomers) 指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。不同。example:example:限制酶限制酶hpahpa和和mspmsp是一對(duì)同裂酶是一對(duì)同裂酶 (ccgg) (ccgg) ，當(dāng)靶序列中一個(gè)當(dāng)靶序列中一個(gè)5-5-甲基胞嘧啶時(shí)甲基胞嘧啶時(shí)hpahpa不能進(jìn)行不能進(jìn)行切割，而切割，而mspmsp可以。可以

16、。同尾酶同尾酶（isocaudamerisocaudamer）指來源不同、識(shí)別靶）指來源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。這兩這兩個(gè)相同的粘性末端稱為個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端配伍未端(compatible end)。 ggatcc cctagg agatct tctagagcctag gatcc gatctag gatct a注注 意：意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化很容易重新連接，但是兩種同尾

17、酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。ecor iecor i: : 來自于來自于e escheria scheria cocoli li r ry13y13的第的第一一個(gè)限制酶。個(gè)限制酶。（四）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（四）限制性核酸內(nèi)切酶

18、的命名hin d 屬屬 系系 株株 序序hhaemophilus aemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d d株的第三種酶株的第三種酶（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一個(gè)限制酶單位一個(gè)限制酶單位（u）指：指：在理想的反應(yīng)在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為為37）下，）下，1h內(nèi)內(nèi)中完全降解中完全降解1 g dna所需要的酶量。所需要的酶量。（一）酶（一）酶 切切 反反 應(yīng)應(yīng) 的的 基基 本本 步步 驟驟電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液ckmbuffer (

19、10x) 2.0 lddh2o 約約16.5 ldna 0.21.0 genzyme 12uvolume 20.0 l 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbckmtt0 - 50 mm 低鹽酶100 mm 中鹽酶150 mm 高鹽酶ii 型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：（2-1）對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：（2-2）對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切（二）影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：（二）影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：1.dna1.dna的純

20、度：的純度： dnasednase的污染的污染(mg+)(mg+) a. a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，1 g dna 用 10u 酶 b.b.擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋），擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋）， c. c.延長酶催化反應(yīng)時(shí)間。延長酶催化反應(yīng)時(shí)間。 加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)?shù)臏囟?。的溫度?. dna2. dna的甲基化程度的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5gatc3序列中的腺嘌呤n6位引入甲基，受其影響的酶有bcl i、mboi等，但bamh i、bgl ii、sau3a i不受影響 3. 3. 酶切消化反

21、應(yīng)的溫度：酶切消化反應(yīng)的溫度： 大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度 3737度。度。4. dna4. dna的分子結(jié)構(gòu)：的分子結(jié)構(gòu)： 某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《净虿《綿nadna所需要的酶量要比消化線性所需要的酶量要比消化線性的的dnadna高高2929倍。倍。 （三）核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液1. 1. 氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀： 不正確的不正確的naclnacl或或mg+mg+濃度，會(huì)降低限制酶的活性，濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。 2.

22、 tris-hcl 2. tris-hcl ： 維持最適的維持最適的phph值（值（ ph ph 7.47.4）。）。 3. -3. -巰基乙醇或二硫蘇糖醇（巰基乙醇或二硫蘇糖醇（dttdtt） ： 維持酶的穩(wěn)定性維持酶的穩(wěn)定性。 4. 4. 牛血清蛋白（牛血清蛋白（bsabsa） ：維持酶的穩(wěn)定性維持酶的穩(wěn)定性。（四）核酸內(nèi)切限制酶對(duì)（四）核酸內(nèi)切限制酶對(duì)dnadna的消化作用的消化作用1. 1.核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用。序列發(fā)生作用。2.2.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)核酸內(nèi)切限制酶對(duì)dnadna的局部消化的局部消化完全的酶切消化：識(shí)別序列完全的

23、酶切消化：識(shí)別序列n n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)限制酶，對(duì)dnadna的切割能達(dá)到每隔的切割能達(dá)到每隔4 4n n切割一次切割一次的水平。的水平。局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的dnadna消化完全，就可以獲得平均分子量大小有消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶消化反應(yīng)。消化反應(yīng)。 a. a. 縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時(shí)間縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時(shí)間 b. b. 降低反應(yīng)的溫度（降低反應(yīng)的溫度（37-437-4）結(jié)束酶的活性。）結(jié)束酶的活性。3.3.

24、核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用作用小分子量的片斷小分子量的片斷-少少 （電泳（電泳- -容易分離目的片斷）容易分離目的片斷） 大分子量的片斷大分子量的片斷-多（基因文庫多（基因文庫） 星號(hào)活性？星號(hào)活性？在在“非最適的非最適的”反應(yīng)條件下反應(yīng)條件下, ,有些核酸內(nèi)切有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松松動(dòng)動(dòng)”，從其，從其“正確正確”識(shí)別序列以外的其識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割它位點(diǎn)切割dnadna分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活性。用性。用* *表示。表示。 連接酶（連接酶（dna ligasedn

25、a ligase）與分子的體外連接與分子的體外連接末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal transferaseterminal transferase） 該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal terminal deoxynucleotidyl transferasedeoxynucleotidyl transferase），），它是從小牛胸腺它是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化甲胂酸緩沖液中，能催化5 5脫氧核苷三磷酸進(jìn)行脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5 53 3方

26、向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性子加到線性dnadna分子的分子的3 3-oh-oh末端。末端。 它不需要模板，可以用含有的它不需要模板，可以用含有的3 3-oh-oh片段為引物，在片段為引物，在3 3-oh-oh端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。 它作用的底物可以是具有它作用的底物可以是具有3 3-oh-oh末端的單鏈末端的單鏈dna,dna,也可以是具有也可以是具有3 3-oh-oh突出末端的雙鏈突出末端的雙鏈dnadna 用途：用途： 1. 1. 催化催化 -3232p p-3-3- -脫氧核苷酸標(biāo)記脫氧核苷酸標(biāo)記dnadna片斷

27、的片斷的3 3 末端。可用于測(cè)序的終止，一位不含游離的末端?？捎糜跍y(cè)序的終止，一位不含游離的3 3- -ohoh末端。末端。 2. 2. 催化非放射性的標(biāo)記物摻入到催化非放射性的標(biāo)記物摻入到dnadna片斷的片斷的3 3- -末端：末端： 生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。 3. 3. 用于在平頭上合成一段寡聚核苷酸，用于在平頭上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。從而形成粘性末端。堿性磷酸酶：堿性磷酸酶： 來自于大腸桿菌（來自于大腸桿菌（bacterial alkaline bacterial alk

28、aline phosphatase bapphosphatase bap）或小牛腸（）或小牛腸（calf intestinal calf intestinal alkaline phosphatase cipalkaline phosphatase cip），該酶用于脫去），該酶用于脫去dnadna（rnarna）5 5末端的磷酸根，使末端的磷酸根，使5 5-p-p成為成為5 5-oh-oh，該過程稱核酸分子的該過程稱核酸分子的脫磷酸作用脫磷酸作用。當(dāng)需要。當(dāng)需要5 5端同端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊馕凰貥?biāo)記或?yàn)榱吮苊鈊nadna片段自身連接（或環(huán)片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。化）時(shí)可進(jìn)

29、行脫磷酸反應(yīng)。 s1s1核酸酶：核酸酶： 來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈dnadna，用于將粘性末端水解成平末端及，用于將粘性末端水解成平末端及cdnacdna發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。反轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptasereverse transcriptase） 這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以rnarna為模板，催化合成。目前常為模板，催化合成。目前常用的有禽源（用的有禽源（amvamv）及鼠源（）及鼠源（m-mlvm-mlv）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。反轉(zhuǎn)錄酶兩種。 體外連接的三種方式：體外連接的三種方式

30、： 1. 1. 用用連接酶連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的連接具有互補(bǔ)粘性末端的dnadna片斷片斷 2. 2. 用用連接酶連接酶將平末端的將平末端的dnadna片斷連接；片斷連接；或是用或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的給具平末端的dnadna片斷加上片斷加上poly(a)- poly(t)poly(a)- poly(t)尾巴之后，再用尾巴之后，再用連接酶連接。連接酶連接。 3. 3. 先在先在dnadna片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用連接酶連接頭，形成粘性末端后，再用連接酶連接 連接酶：連接酶： 能夠?qū)⒛軌驅(qū)n

31、adna鏈上彼此相鄰的鏈上彼此相鄰的3 3- -羥基羥基（ oh oh ）和）和5 5- -磷酸基團(tuán)（磷酸基團(tuán)（-p-p），在），在nad+nad+或或atpatp供能的作用下，形成磷酸二供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。酯鍵。 只能連接缺口（只能連接缺口（nicknick），不能連接裂口），不能連接裂口（gapgap）。而且被連接的）。而且被連接的dnadna鏈必須是雙鏈必須是雙螺旋螺旋dnadna分子的一部分。分子的一部分。 酶amp（腺苷磷酸） 磷酸酰胺鍵dnadna的腺苷酸復(fù)合物的腺苷酸復(fù)合物3 3-oh-oh對(duì)對(duì)p p原子作親核攻擊原子作親核攻擊 形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵連接酶的作用

32、機(jī)理連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸此反應(yīng)是由焦磷酸 (ppi)(ppi)的水解作用激發(fā)的的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴氨酸殘基） 限制片斷的末端連接作用限制片斷的末端連接作用 分子間的連接：不同的分子間的連接：不同的dnadna片斷通過互片斷通過互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來。接起來。 分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。 連接酶的來源連接酶的來源 1. dna1. dna連接酶：連接酶： 大腸桿菌染色體編碼的

33、大腸桿菌染色體編碼的 2. t2. t4 4 dna dna連接酶：大腸桿菌連接酶：大腸桿菌t t4 4噬菌體噬菌體dnadna編碼的編碼的 dnadna連接酶連接酶 nad+nad+ t t4 4 dna dna連接酶連接酶 atpatp連接酶（連接酶（dna ligasedna ligase） 該酶常從該酶常從噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是的連接酶是連接酶。它可催化中磷酸二連接酶。它可催化中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形

34、式結(jié)合起來。合起來。 dnadna連接酶對(duì)具有粘性末端的連接酶對(duì)具有粘性末端的dnadna分子經(jīng)退分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的火后能很好地連接，對(duì)平末端的dnadna分子也可以分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。 影響連接酶作用的因素影響連接酶作用的因素 1. 1. 反應(yīng)溫度：反應(yīng)溫度： 連接缺口的溫度：連接缺口的溫度：3737度度 連接粘性末端的最佳溫度：連接粘性末端的最佳溫度： 4 41515度度 2.2.連接酶的用量：連接酶的用量： 平末端平末端dnadna分子的連接反應(yīng)中，最適分子的連接反應(yīng)中，最適1 12 2個(gè)單位。

35、個(gè)單位。 粘性末端粘性末端dnadna片斷之間的連接，酶濃度片斷之間的連接，酶濃度0.10.1個(gè)單位。個(gè)單位。 atpatp的用量的用量10mol1mmol/l10mol1mmol/l之間之間 3. 3. 提高外源片斷與載體的濃度的比值，（提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10102020倍）倍） 粘性末端粘性末端dandan片斷的連接片斷的連接 由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。 對(duì)載體的對(duì)載體的5 5末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。能自連。 而外源片斷的而外

36、源片斷的5 5-p-p能與載體的能與載體的3 3-oh-oh進(jìn)進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體dnadna只有一條鏈與外只有一條鏈與外源片斷相連，失去源片斷相連，失去5 5-p-p的鏈不能進(jìn)行連接，的鏈不能進(jìn)行連接，形成形成3 3- oh - oh 和和5 5- oh - oh 的缺口。的缺口。 平末端平末端dnadna片斷的連接片斷的連接 1. t4dna1. t4dna連接酶連接酶 2. 2. 用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用物尾巴之后，再用dnadna

37、連接酶連接。連接酶連接。 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法物法和接頭連接法 同聚物加尾法同聚物加尾法用用5 5 末端特異的核酸外切酶處理末端特異的核酸外切酶處理dnadna片斷片斷在在a a和和b b分別中加入分別中加入datpdatp和和dttpdttp同聚物尾巴同聚物尾巴10401040個(gè)堿基個(gè)堿基 同聚物加尾法或同聚物加尾法或t4t4連接酶的平連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 銜接物連接法銜接物連接法 平末端

38、的另一種處理方式是利用銜接物（平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linkerlinker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子工合成的小分子dnadna，約，約10201020個(gè)核苷酸，其結(jié)個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：的回文結(jié)構(gòu)。如： ccggatccgg ccggatccgg ggcctaggcc ggcctaggcc 將銜接物分子與平末端將銜接物分子與平末端dnadna分子連接，再用限分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。制性

39、核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)點(diǎn)。 hpa ii hpa iibamh i 或sau3a 銜接物（銜接物（linkerlinker）是指用化學(xué)方法合成是指用化學(xué)方法合成的一段由的一段由10101212個(gè)核苷酸組成、具有個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。的雙鏈寡核苷酸短片段。 雙銜接物：雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。也比較方便。銜接物連接

40、法銜接物連接法雙銜接物連接雙銜接物連接法的基本程序法的基本程序cdna鏈的合成鏈的合成通過通過dna聚合酶合成第二鏈聚合酶合成第二鏈加入加入sal i銜接物銜接物s i核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由由klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物補(bǔ)齊，加入第二銜接物ecol i 在用在用dnadna銜接物連接法時(shí)，如果待克銜接物連接法時(shí)，如果待克隆隆dnadna的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。切斷

41、。dnadna接頭（接頭（adapteradapter）連接法：）連接法： 19781978年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞的教授吳瑞 博士發(fā)明的。博士發(fā)明的。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。苷酸短片斷。 粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)接物一樣的二聚體分子。對(duì)dnadna接頭分子末接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5 5

42、-p-p，暴，暴露出露出5 5-oh-oh，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。dna接頭連接法接頭連接法 熱穩(wěn)定的連接熱穩(wěn)定的連接 從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。用的一種核酸酶。1. 1.寡核苷酸連接測(cè)定寡核苷酸連接測(cè)定 （oligonucletide ligation assay,olaoligonucletide ligation assay,ola） 用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶dnadna雜交，

43、雜交，探針在靶探針在靶 dnadna分子的位置是相鄰的。分子的位置是相鄰的。2.2.連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lingase chain reaction,lcrlingase chain reaction,lcr）；）； 也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（ lingase amplication reactionlingase amplication reaction） 用寡核苷酸探針通過用寡核苷酸探針通過dnadna連接酶的作用擴(kuò)增已知連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶序列的靶dnadna的方法。需要的方法。需要4 4種引物，種引物， 寡核苷酸連接測(cè)定寡核苷酸連接測(cè)定 agtgacct

44、tcactgga a g t g a c c t a g t t a c c t t c a c t g g a t c a c t g g a a g t g a c c t a c c t a g t g a c c t a c c t 待擴(kuò)增的待擴(kuò)增的dna片斷片斷ppbbdd地高辛配基地高辛配基生物素生物素磷酸磷酸bbbbddpp陽性信號(hào)陽性信號(hào)無信號(hào)無信號(hào)酶抗生素蛋白酶抗生素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性lcr：ligase chain reaction，連接酶鏈

45、式反應(yīng)。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。樣品樣品dna、探針、探針(4) 94度變性度變性dnadna聚合酶聚合酶 常用的常用的dnadna聚合酶：聚合酶： 大腸桿菌大腸桿菌dnadna聚合酶、聚合酶、 大腸桿菌大腸桿菌dnadna聚合酶的聚合酶的klenowklenow大片斷酶、大片斷酶、 t t4 4dnadna聚合酶、聚合酶、 t t7 7dnadna聚合酶、聚合酶、 反轉(zhuǎn)錄酶等。反轉(zhuǎn)錄酶等。共同點(diǎn)：共同點(diǎn)： 把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈dnadna分子引物鏈的分子引物鏈的3 3-oh-oh末端，催化核末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板苷酸的聚合作用，而不發(fā)生

46、從引物模板上解離的情況。上解離的情況。 大腸桿菌大腸桿菌dnadna聚合酶聚合酶 dnadna聚合酶（聚合酶（polpol）、）、 dnadna聚合酶聚合酶（pol pol ）、）、 dnadna聚合酶聚合酶 （pol pol ）、）、 polpol和和pol pol 的主要功能參與的主要功能參與dnadna的合成；的合成； pol pol 的功能同的功能同dnadna的復(fù)制有關(guān)；的復(fù)制有關(guān)； polpol同同dnadna分子克隆的關(guān)系最為密切。分子克隆的關(guān)系最為密切。大腸桿菌大腸桿菌dnadna聚合酶：聚合酶： 19571957年，美國的生物學(xué)家年，美國的生物學(xué)家a.kornberga.ko

47、rnberg首首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種dnadna聚合酶，即現(xiàn)在所說的聚合酶，即現(xiàn)在所說的dnadna聚合酶。由聚合酶。由polpol基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為量為1091091000dal1000dal。 dnadna聚合酶，可以被蛋白酶切割成兩聚合酶，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的3 3 5 5的外切酶活的外切酶活性和性和5 5 3 3 的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部 5 5 3 3的外切酶活性。的外切酶活性。 dnadna聚合酶聚合酶的酶

48、活性：的酶活性： 1. 51. 5 3 3的聚合酶活性；的聚合酶活性； 2. 52. 5 3 3的外切酶活性；的外切酶活性； 3. 33. 3 5 5的外切酶活性（較低）。的外切酶活性（較低）。 dnadna聚合酶發(fā)揮作用的條件：聚合酶發(fā)揮作用的條件： 1 1、底物：、底物： 四種脫氧核苷四種脫氧核苷5 5- -三磷酸（三磷酸（dntpdntp）；）； 2 2、mgmg離子離子； 3 3、帶有、帶有3 3-oh-oh游離基團(tuán)的引物鏈；游離基團(tuán)的引物鏈； 4 4、dnadna模板：單鏈，雙鏈（模板：單鏈，雙鏈（糖糖- -磷酸主鍵上有一個(gè)磷酸主鍵上有一個(gè) 或多個(gè)斷裂或多個(gè)斷裂）。）。 dnadna

49、聚合酶聚合酶5 5 3 3的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 1 1、 5 5 3 3的外切酶活性，所切割的的外切酶活性，所切割的dnadna鏈鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；必須是位于雙螺旋的區(qū)段上； 2 2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距可以是在距5 5末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；發(fā)生； 3 3、dnadna的合成可以增強(qiáng)的合成可以增強(qiáng)5 5 3 3的核酸外的核酸外切酶活性；切酶活性； 4 4、 5 5 3 3核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及作用的活性位點(diǎn)以及3 3 5 5的水解作用

50、位點(diǎn)是的水解作用位點(diǎn)是分開的。分開的。 dnadna聚合酶的聚合酶的3 3 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 能催化能催化dnadna鏈發(fā)生水解作用，從鏈發(fā)生水解作用，從dnadna鏈鏈3 3- -ohoh末端開始向末端開始向5 5的方向水解的方向水解dnadna，并釋放出，并釋放出單核苷酸分子。單核苷酸分子。 對(duì)酶活的影響：對(duì)酶活的影響： 反應(yīng)物中缺乏反應(yīng)物中缺乏dntpsdntps時(shí)，大腸桿菌時(shí)，大腸桿菌dnadna聚聚合酶的合酶的3 3 5 5核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的但對(duì)于底物是雙鏈的dnadna，在具有，在具有dntpsdntp

51、s時(shí)，時(shí)，這種降解活性將會(huì)被這種降解活性將會(huì)被5 5 3 3 的聚合酶活性所抑制的聚合酶活性所抑制。 dnadna聚合酶在分子克隆中的主要用途：聚合酶在分子克隆中的主要用途： 通過通過dnadna缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的放射性標(biāo)記的dnadna探針。探針。 dnadna缺口轉(zhuǎn)移（缺口轉(zhuǎn)移（nick translationnick translation） 在在dnadna分子的單鏈缺口上，分子的單鏈缺口上，dnadna聚合酶的聚合酶的5 5 3 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶

52、活性從缺口的活性從缺口的5 5一側(cè)移去一個(gè)一側(cè)移去一個(gè)5 5核苷酸之后，聚合酶核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的作用就會(huì)在缺口的3 3一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polpol不能在不能在3 3-oh-oh和和5 5-p-p之間形成一個(gè)鍵，隨著之間形成一個(gè)鍵，隨著5 5一側(cè)的一側(cè)的核苷酸不斷移去，核苷酸不斷移去， 3 3一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著口便沿著dnadna分子合成的方向移動(dòng)。分子合成的方向移動(dòng)。 dnadna雜交探針的制備雜交探針的制備 典型的反應(yīng)體系是。在典型的反應(yīng)體系是。在25l25l總體積中總體積中含有含有1 g1 g

53、純化的特定純化的特定dnadna片斷，并加入片斷，并加入適量的適量的dnasednase、polpol、-32p-dntps-32p-dntps和未標(biāo)記的和未標(biāo)記的dntpsdntps。 dnasednase：造成：造成dnadna分子的斷裂或缺口；分子的斷裂或缺口； polpol ： 進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的中的32p32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。 dntp dntp 對(duì)對(duì)polpol酶活性的影響酶活性的影響 在低濃度在低濃度dntpsdntps的條件下，的條件下，

54、 polpol具具有良好的活性有良好的活性，提高提高dntpsdntps濃度時(shí)，濃度時(shí)， polpol則能夠更有效的合成則能夠更有效的合成dnadna。 低濃度的低濃度的 3232p-dntpsp-dntps（2 mol/l2 mol/l）和高濃度的和高濃度的dntpsdntps（ 20 mol/l 20 mol/l ） 一般希望有一般希望有30%30%左右的左右的3232p-dntpsp-dntps參入?yún)⑷雂nadna鏈（鏈（ dnasednase數(shù)量）。數(shù)量）。 klenowklenow片斷與片斷與dnadna末端標(biāo)記末端標(biāo)記 1 1、 klenowklenow片斷：是由大腸桿菌片斷：是由

55、大腸桿菌dnadna聚合聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為來的分子量為76761000dal1000dal的大片斷分子。的大片斷分子。仍具有仍具有5 5 3 3的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的外切的外切酶活性，失去了全酶的酶活性，失去了全酶的5 5 3 3 外切酶活性。外切酶活性。 klenowklenow片斷的主要用途：片斷的主要用途： 1 1、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的dnadna所形成的所形成的3 3隱蔽末端；隱蔽末端； 2 2、標(biāo)記、標(biāo)記dnadna片斷的末端；片斷的末端； 3 3、cdnacdna克隆的第

56、二鏈克隆的第二鏈cdnacdna的合成；的合成； 4 4、dnadna序列的測(cè)定。序列的測(cè)定。 dnadna片斷末端標(biāo)記：片斷末端標(biāo)記： 具有具有 3 3隱蔽末端的帶標(biāo)記得的隱蔽末端的帶標(biāo)記得的dnadna片斷片斷 5 5gatctgatct3 3 3 3 a a5 5在反應(yīng)物中加入在反應(yīng)物中加入klenowklenow聚合酶聚合酶-32p-dgtp,-32p-dgtp,一道溫育后生成：一道溫育后生成： 5 5gatctgatct3 3 3 3 32p32p ga ga5 5 或是同時(shí)加入或是同時(shí)加入-32p-datp-32p-datp dgtpdgtp5 5gatctgatct3 33 33

57、2p32p aga aga5 5 dnadna片斷末端標(biāo)記可以作為用凝片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因?yàn)楸粯?biāo)記的為被標(biāo)記的dnadna片斷是同它們的摩爾濃片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小dnadna片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。 不能夠有效的標(biāo)記帶有不能夠有效的標(biāo)記帶有5 5突出末端突出末端的的dnadna分子。分子。 t t4 4dnadna聚合酶和聚合酶和 取代合成法標(biāo)記取代合成法標(biāo)記dnadna片斷片斷 1 1、從、從t4t4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的特殊的dnadna聚合酶。具有聚合酶。具有5 5 3 3的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的的外切酶活性。外切酶活性。 2 2、 在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3 3外切酶活外切酶活性便是性便是t4 dnat4