三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮方法的探討

1、DOC 格式論文，方便您的復制修改刪減三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮方法的探討（作者：單位：郵編：）作者：馬陶陶 張群林 李俊 孟曉明 黃成 陳玉璞【摘要】目的探討以蘆丁作為對照品，采用三氯化鋁（A1C13 ）比色法測定中藥總黃酮含量的專屬性，并建立A1C13比 色法測定中藥總黃酮含量的最優(yōu)條件。方法通過對幾類典型結構的黃 酮類及多酚類化合物A1C13顯色前后的吸收峰（2 0 06 00 nm）進行比較，分析以蘆丁為對照品的A1C13比色法測定中藥總黃酮的合理性。結果A1C13顯色后，部分黃酮類物質在421 nm處有較強吸收。結論采用A1C13比色法測定中藥總黃酮的含量具有合理性，并建立了A1C

2、13比色法測定中藥總黃酮含量的最優(yōu)條件。【關鍵詞】 A1C13比色法總黃酮蘆丁Abstract : Objective To discuss the speci a1ity of A1C13 co1orimetry with rutin as reference substance fo r eva1uation on the content of totai flavonoids and investigate the optimum condition of A1C13 c olorimetry. MethodsTomake a series of flavonoids and polyp

3、henols with typical structure with AlCl3 and measure their absorption curves at the r ange of 2 0 0600 nm. Results At the wavelength of 421 nm,some flav ono id-like compo unds showed the similar absorption with rutin . Con clusi on It is reasonabl e to determine the total flavonoi ds by using AlCl3

4、colorimetry wi th rutin as reference substance and establish the optimum condi tion of AlCl3 colorimetry.Key words: AlC3 c olorimetry; Total f lavonoids; Rutin黃酮類化合物(Flavonoids )是以C6C3-C6結構為基本母核的色原烷或色原酮的衍生物，以其廣泛的藥 理作用倍受青睞，而中藥材中總黃酮的含量測定成為近年來研究黃酮 化合物所關注的焦點。中藥總黃酮的含量測定一般采用比色法、 高效液相色譜法等1。比色法是被中國藥典所采用的最常見

5、的 總黃酮測定方法，其中又以NaNO2-A1（NO3 ）3 NaOH比色法常用2。這種方法以NaNO2 A1（NO 3 ） 3為顯色劑，在堿性條件下，利用其與黃酮物質生成紅色鋁螯 合物為特征，以蘆丁為對照，在5 10 nm處測定吸光度，從而得 到待測物質總黃酮的含量。郭亞建等3曾對這種方法的專屬性進行了討論，發(fā)現(xiàn)具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質在蘆丁顯色的最大 波長處（5 10 nm左右）也有較強吸收，而黃酮類成分黃芩素、 山柰酚在此波長處沒有吸收，從而說明采用NaNO2A1（NO3 ） 3 NaOH 比色法，以蘆丁作為對照，不能排除非黃酮 類物質的干擾，這種方法測定中藥總黃酮含量的專屬性不強。因

6、此，本實驗采用另一種常用的比色法：A1C13比色法，對幾類典型結構的黃酮類化合物（蘆丁、兒茶素、木犀草素、鼠 李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金絲桃苷、橙皮苷）及多酚類化 合物（2，3 二羥基苯甲酸，綠原酸，和厚樸酚，阿魏酸）A1 C13顯色前后的吸收峰（2 0 0600 nm）進行比較，分析以蘆丁為對照品的A1C13 比色法測定中藥總黃酮的合理性， 并對蘆丁顯色的pH 值，A1C13濃度、顯色溫度等條件進行優(yōu) 化研究。1儀器與試藥Agilent 8 4 5 3 紫外分光光度計；PHS 3 C精密pH計（上海雷磁儀器廠）。試劑：蘆丁，葛根素，2,3 二羥基苯甲酸，綠原酸， 和厚樸酚，阿魏酸，兒

7、茶素，木犀草素，異鼠李素，山柰奈酚，槲皮 素，金絲桃苷，蒙花苷、橙皮苷均購自中國藥品生物制品檢定所。三 氯化鋁，醋酸鈉，冰醋酸，甲醇均為分析純，水為雙蒸水。2方法2.1供試品的制備以蘆丁為例，精密稱取蘆丁標準品（12 0 C 烘干至恒重）10. 0 mg，甲醇定容至50 ml，配成0 .2m g/ml的蘆丁母液。2.2顯色試劑的配置精密稱取A1C13 1.34 g，甲醇定 容至10 0ml，配成0.1 mol/L 的溶液。精密稱取CH3COONa3H2O 2.72 g，雙蒸水溶解至100 ml， 配成0.2 mol/L 的溶液。精密量取1 .15 ml冰醋酸， 雙蒸水稀釋至10 0 ml配成0

8、. 2 mol/L 的醋酸溶液4, 5。2.3蘆丁紫外吸收峰的掃描精密量取1ml蘆丁母液溶液，置于10 ml 容量瓶，加入2 ml 0. 1 mol/L 的AlCl 3溶液，甲醇定容，充分顯色2 0min6，在2 0 060 0 nm范圍掃描，記錄吸光度值。2.4供試品紫外吸收峰的掃描精密量取1 ml供試品（蘆丁,葛根素，2,3 二羥基苯甲酸、綠原酸、阿魏酸、和厚樸酚、兒 茶素、木犀草素、異鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、金絲桃苷、蒙花苷、 橙皮苷)，按“2.3” 項下方法，在2 0 06 0 0 nm掃描樣品的紫外吸收峰。2.5標準曲線及可行性考察從蘆丁母液中精密移取0.0， 0.2，0.4，0.

9、6，0.8，1.0 ml 溶液，平行兩份， 第1份直接加入2 ml 0. 1 mol/L 的A1C13 顯色2 0 min;第2 份加入2 ml 0. 1 mol/L A1C13，1ml pH為5.2 的NaAC HAC緩沖溶液，40C水 浴顯色10 min，分別做標準曲線，并以金絲桃苷為樣品，考察 方法的可行性。3結果3.1蘆丁顯色的紫外光譜圖在黃酮類化合物的紫外光譜圖上， 主 要有苯甲酰基部分引起的吸收帶I (3004 0 0 nm)和桂 皮?；糠忠鸬奈諑I (2402 8 0 nm)，加人鋁鹽 可使黃酮類化合物與鋁離子形成穩(wěn)定的絡合物，帶I 紅移，吸光度 明顯增大。當加入AlCl

10、3 充分顯色后，蘆丁吸收峰從359 n m紅移至4 2 1 nm，且吸光度有所增加。見圖1。圖1蘆丁加入AlCl3 前后的紫外光譜圖(略)3.2 AlCl3 比色法專屬性探討在2 0 06 0 0 nm對幾種典型結構的黃酮類物質及多酚類物質AlCl3 顯色前后的 紫外吸收峰進行比較，結果發(fā)現(xiàn)顯色后金絲桃苷、異鼠李素、山柰奈 酚的吸收峰位置和蘆丁的相似，都在4 2 1 nm左右，而其他物質 的與蘆丁的不同。如圖2 為顯色后各物質的紫外光譜圖。圖214種物質顯色后的紫外光譜圖(略)3.3顯色條件的優(yōu)化331 pH值的影響采用NaAc -HAc緩沖鹽溶液調節(jié) 溶液的pH 值，實驗表明，當緩沖鹽的pH

11、 值小于5.2時，蘆 丁的吸收峰在4 0 2 nm 左右，且吸光度值較?。划攑H 值在5.2 6.0 時，吸收峰在421 nm 左右，吸光度值增大，如圖3(a)。且當pH值為5.2時，吸光度值最大，因此選擇p H為5. 2的NaAc -HAc緩沖鹽體系作為優(yōu)化的顯色條件 之一。3.3.2 A1C13 的濃度以2X10-5 g/ml 的蘆丁溶液，pH 值5. 2的NaAc -HAc 緩沖鹽為條件，在6. 6 X10-50 .33 mol/L 范圍內討論A1C13 濃度對蘆丁吸收峰的位置及吸光度大小的影響， 結果發(fā)現(xiàn)：1：6 0 0 W n 蘆?。?nA1C13W1：2 時，即A1C13 濃度為3

12、.3 X 10-40.1 mo1/L 時，吸收峰在421 nm 左右，且 吸光度的值隨A1C13 濃度的增加而變大。如圖3(b )所示。n 蘆丁 ： nA1C13 1:2，即 A1C13 濃度小于 3.3 X1 0-4 mo1/L 時，吸收峰在3 6 5 nm 左右，且吸光度減小。 n 蘆?。?nA1C13v1:600，即 A1C13 濃度大于0.1mo1/L，吸收峰移至4 0 4nm 左右，且吸光度減小。因此選擇A1C13 濃度為0.1 mol/L 為蘆丁顯 色的優(yōu)化條件之一。333顯色溫度對吸光度的影響實驗中由于顯色時間較長，為了提高效率，采用水浴加熱。加熱10min,考察水浴溫度對吸收峰

13、位置及吸光度大小的影響。如圖3(c)。結果表明，水浴溫度4 0C是蘆丁顯色的優(yōu)化條件之一。圖3顯色條件對蘆丁吸光度的影響(略)3.4顯色穩(wěn)定性考察以2X10-5 g/ml 蘆丁溶液，0.1 mo1/LA1C13 ，pH 值5.2NaAc -HAc 緩沖溶液為條件，考察顯色的穩(wěn)定性，結果表明，顯色15 0min，吸光度變化的RSD為2.862%，說明以蘆丁為對照，A1C 13比色法顯色穩(wěn)定。3.5線性及可行性考察以一定濃度的金絲桃苷作為樣品，直接加入2 m1 0.1 mo1/L 的 A1C13 ，顯色20 min， 其標準方程：Y= 0.0 0 779 + 273 5 1.1 9 04 8 X，

14、RA = 0.9 9 9 22，測得的金絲桃苷的濃度是2.75X104 g/m1，回收率為12 1.15% ;而優(yōu)化后的方法：2m10.1 mo1/L A1C13，1 m1 pH 為 5.2 的NaAc HAc 緩沖溶液，4 0C水浴顯色10 min， 其線 性方程為 Y= 0.0 0 153+295 9 5.2 0 93 2 X，RE=0. 9 9 97 2,測得的金絲桃苷濃度為2.3 0 6 X 1 0 4 g/ml，回收率為10 1.58%。由此說明0.1mol/L A1C13, pH5.2 的NaAc -HAc 緩沖鹽溶液，40C 水浴顯色10 min,方法的準確度更高，為A1C13

15、比色法的 優(yōu)化方法。4討論葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入A1C13，反應前后紫外吸收峰的位置沒有發(fā)生改變，而其余物質的紫外吸收峰均發(fā)生紅移。 從結構上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在5位羥基，不存在鄰二酚羥基和3 位羥基，由此可見A1C13 的顯色反應主要發(fā)生 在3位羥基、4位羰基和鄰二酚羥基，只存在5 位羥基、4 位羰 基時黃酮類物質與A1C13 不發(fā)生反應。蘆丁與A1C13 發(fā)生顯色反應，生成黃色絡合物，在421 nm左右有較強吸收。實驗對幾種常見的多酚類化合物紫外光 譜圖進行了掃描，結果表明對于含鄰二酚羥基的非黃酮化合物：2，3 二羥基苯甲酸、阿魏酸、和厚樸酚、綠原酸，A1C13 顯色 前

16、后在4 2 1nm 左右均沒有吸收峰，消除了非黃酮類化合物對顯 色的干擾。槲皮素為蘆丁的苷元，顯色后在437 nm左右有較大吸收，而蘆丁的最大吸收峰在4 2 1nm，說明黃酮的苷和苷元的極 性相差較大，槲皮素3 位羥基可能對反應有影響。木犀草素的結構 和蘆丁相比，3 位沒有羥基，顯色后在4 14 nm有最大吸收， 從而進一步說明3 位羥基可能對A1C13 顯色反應有影響。具有典型結構的常見的黃酮類苷和苷元：金絲桃苷，蘆丁， 異鼠李素，山柰奈酚，A1C13顯色前在4 2 1 nm處無吸收， 顯色后均在蘆丁的最大吸收峰421 nm左右有較大的吸收。在現(xiàn) 今的實驗條件下，對于大多數(shù)黃酮類中藥材而言，

17、多含有黃酮苷，常 見的苷在此波長處有較強吸收，而非黃酮類物質在此處無吸收。因此 以蘆丁作為對照，A1C13比色法可以成為測定中藥總黃酮含量的 理想方法。對于任一絡合反應，溶液的酸堿度會影響金屬離子的水解及存在形式，影響絡合物的組成。當采用鹽酸（氫氧化鈉）調節(jié)顯色溶液pH值時，因其酸（堿）性較強，破壞絡合物的結構，無法測得 中藥總黃酮含量的真實值，而采用NaAc-HAc緩沖鹽溶液時，加入前后蘆丁的吸收峰位置不變，仍在3 5 9 nm處，所以采 用NaAc -HAc緩沖鹽調節(jié)顯色溶液的pH 值。從方法的可行性考察結果可以看出， 以金絲桃苷為樣品，采 用2種方法考察回收率，優(yōu)化的方法準確度更高，所以

18、加入0. 1 mo1/L A1C13，pH 為5. 2 的NaAc -HAc 緩沖 溶液，40C水浴加熱10 min為A1C13 比色法的優(yōu)化顯 色條件?！緟⒖嘉墨I】:1鄭健，陳煥文，劉宏偉，等.紫外可見分光光度法在藥物分析中的應用J.分析科學學報，2 0 0 2，18(2): 15 8.:2國家藥典委員會.中國藥典，1 部S.北京：化 學工業(yè)出版社，2 0 0 5:2 5 6.:3郭亞健，范 麗，張珍蘭，等.關于比色法測定總黃酮方法的探討J.藥物分析雜志，2002，22(2): 9 7.:4 丁明玉，趙紀萍，李擎陽.貫葉金絲桃提取物中總黃 酮的測定方法J.分析實驗室，2001，20(6): 4 5.:5張錫瑜.分析化學原理，第2 版M.北京：科學 出版社，2 0 0 0:3 9 8.:6劉斌，石任兵，王 偉.蒲黃總黃酮含量測定方法的研究J.北京中醫(yī)藥大學學報，2001，24(4): 2 3.溶液，40C水浴加熱10 min為A1C13 比色法的優(yōu)化顯色條件。【參考文獻】 1 鄭 健，陳煥文，劉宏偉，等紫外可見分光光度法在