高效液相色譜詳解郝建濤課件

1、高效液相色譜詳解郝建濤1 高效液相色譜高效液相色譜 （HPLC） 主講：郝鳳霞主講：郝鳳霞 能源化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室能源化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 高效液相色譜詳解郝建濤2 目目 錄錄 v 基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)理論 v 上機(jī)操作前的準(zhǔn)備工作上機(jī)操作前的準(zhǔn)備工作 v Agillent 1100 的操作的操作 v 常見故障排除常見故障排除 v HPLC在科研中的應(yīng)用在科研中的應(yīng)用 高效液相色譜詳解郝建濤3 一、基礎(chǔ)理論一、基礎(chǔ)理論 高效液相色譜詳解郝建濤4 溶于流動相溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固中的各組分經(jīng)過固 定相時，由于與固定相定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作發(fā)生

2、作 用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的 大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時間不同，大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時間不同， 從而先后從固定相中流出。從而先后從固定相中流出。 1、色譜柱的分離原理色譜柱的分離原理 高效液相色譜詳解郝建濤5 色譜分析法的分類色譜分析法的分類 v按兩相的狀態(tài)分類按兩相的狀態(tài)分類 流動相流動相液體液體流動相流動相氣體氣體 固定相固定相固體固體液體液體固定相固定相固體固體液體液體 名稱名稱液固色譜液固色譜液液色譜液液色譜名稱名稱氣固色譜氣固色譜氣液色譜氣液色譜 總稱總稱液相色譜液相色譜總稱總稱氣相色譜氣相色譜 高效液相色譜詳解

3、郝建濤6 2、分離模式、分離模式鍵合相色譜、液液色譜、尺鍵合相色譜、液液色譜、尺 寸排阻色譜寸排阻色譜 鍵合相色譜鍵合相色譜 正相色譜： 流動相極性 固定相極性 常規(guī)分析，80 高效液相色譜詳解郝建濤7 色譜圖和峰參數(shù)色譜圖和峰參數(shù) v色譜圖色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到 的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線。 v基線基線(base line)-經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達(dá)到平衡后， 檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。 v噪音噪音(noise)-基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時 過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。 v漂

4、移漂移(drift)-基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如 電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物 或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。 3、HPLC中的基本概念和術(shù)語中的基本概念和術(shù)語 高效液相色譜詳解郝建濤8 v色譜峰色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的 曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲 線（高斯Gauss曲線）。 v峰高峰高(peak height，h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。 v峰寬（峰寬（peak width，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基 線的兩個交點(diǎn)間的距離。 v半峰寬（半峰寬（peak width at half-h

5、eight，Wh/2)-峰高一半處的 峰寬。 v峰面積峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。 v死時間死時間(dead time，t0)-不保留組分的保留時間。即流動 相（溶劑）通過色譜柱的時間。 v保留時間保留時間(retention time，tR)-從進(jìn)樣開始到某個組分在 柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。 高效液相色譜詳解郝建濤9 流動相的洗脫方式 洗脫方式 等度洗脫低壓梯度 高壓梯度 高效液相色譜詳解郝建濤10 等度洗脫 輸輸液液泵泵 進(jìn)樣進(jìn)樣器器 色色譜譜柱柱 柱溫箱柱溫箱 檢測檢測器器 高效液相色譜詳解郝建濤11 梯度洗脫 A 泵泵 進(jìn)樣進(jìn)樣器器 色色譜譜柱柱 柱溫箱柱

6、溫箱 檢測檢測器器 B泵泵 A B 時間時間 B 濃濃度度 高效液相色譜詳解郝建濤12 MeOH / H2O = 4 / 6 MeOH / H2O = 8 / 2 等度洗脫等度洗脫 高效液相色譜詳解郝建濤13 95% 30% MeOH 濃 濃度度 梯度洗脫 高效液相色譜詳解郝建濤14 梯度洗脫是梯度洗脫是 HPLC 的常用手段的常用手段 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 流動相中含有兩種或兩種以上不同極性的 溶劑，在洗脫過程中連續(xù)或間斷的改變流動相 的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使樣品中每個組分 都有較高的分離度，從而實(shí)現(xiàn)各組分的圓滿分 離，梯度洗脫可提高柱效，縮短分析時間，改 善檢測器的靈敏度，它類似于氣

7、相色譜的程序 升溫技術(shù)。 高效液相色譜詳解郝建濤15 高效液相色譜詳解郝建濤16 4、高效液相色譜法的應(yīng)用范圍、高效液相色譜法的應(yīng)用范圍 高效液相色譜法適于分析沸點(diǎn)高、相對分子 質(zhì)量大，受熱易分解的不穩(wěn)定有機(jī)化合物、生物 活性物質(zhì)以及多種天然產(chǎn)物，這些化合物約占全 部有機(jī)化合物的80%，可應(yīng)用于化工生產(chǎn)、制藥 工業(yè)、食品工業(yè)、生物化工、醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)和環(huán) 境監(jiān)測等領(lǐng)域。 高效液相色譜詳解郝建濤17 5、HPLC的系統(tǒng) v輸液泵 相當(dāng)于人的心臟，不斷提供連續(xù)、穩(wěn)定、精確的 流量 v進(jìn)樣器 樣品引入系統(tǒng) v色譜柱 關(guān)鍵部分，在這里樣品實(shí)現(xiàn)分離 v檢測器 對分離后的樣品進(jìn)行檢測 v數(shù)據(jù)記錄與處理裝置

8、高效液相色譜詳解郝建濤18 數(shù)據(jù)分析 系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) HPLC的系統(tǒng)組成 高效液相色譜詳解郝建濤19 Agilent 1100 高效液相色譜儀 儲液瓶 真空脫氣機(jī) 混合室 自動進(jìn)樣器 分離柱 VWD 高效液相色譜詳解郝建濤20 高效液相色譜詳解郝建濤21 六通閥進(jìn)樣演示 高效液相色譜詳解郝建濤22 分離系統(tǒng)色譜柱分離系統(tǒng)色譜柱 功能：功能： 組分分離組分分離 目標(biāo)：目標(biāo)： 分辨力強(qiáng)分辨力強(qiáng) 效率高效率高 高效液相色譜詳解郝建濤23 吸附劑化學(xué)鍵和固定相色譜柱吸附劑化學(xué)鍵和固定相色譜柱 v化學(xué)鍵合相色譜柱化學(xué)鍵合相色譜柱:70%

9、 將不同的官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵和到硅膠表面的游離羥基上，而將不同的官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵和到硅膠表面的游離羥基上，而 形成化學(xué)鍵和固定相，進(jìn)而形成化學(xué)鍵和相色譜柱。形成化學(xué)鍵和固定相，進(jìn)而形成化學(xué)鍵和相色譜柱。 反相反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。 正相正相: 20%; -NH2、 -CN 其它其它 (手性柱，手性柱， 離子交換柱離子交換柱): 10% 高效液相色譜詳解郝建濤24 柱溫箱柱溫箱 控制溫度，保證分析結(jié)果重控制溫度，保證分析結(jié)果重 現(xiàn)性現(xiàn)性 升高溫度，降低了流動相的升高溫度，

10、降低了流動相的 黏度，降低柱壓，保證色譜黏度，降低柱壓，保證色譜 系統(tǒng)的穩(wěn)定性系統(tǒng)的穩(wěn)定性 高效液相色譜詳解郝建濤25 升溫對于反相升溫對于反相 HPLC分離強(qiáng)疏水肽的影響分離強(qiáng)疏水肽的影響 (B27) 流動相流動相: A: 含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水 B: 含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈 2% B / min 進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 100L (50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸) UV: 210 nm 流速流速: 1 mL/min 室溫室溫 液相色譜柱液相色譜柱: C18 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m 室溫室溫 300C 400C 500C 600C

11、 700C 提高柱溫，可增加柱提高柱溫，可增加柱 效（提高靈敏度）效（提高靈敏度） 高效液相色譜詳解郝建濤26 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 高效液相色譜詳解郝建濤27 高效液相色譜詳解郝建濤28 檢測器簡介（一）檢測器簡介（一） 紫外吸收紫外吸收檢測器（檢測器（UVD） 原理：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的 變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長 可變和光二極管陣列三種類型。 特點(diǎn)：選擇性檢測器、波長檢測范圍：190-800nm ； 對流量和溫度敏感性低、靈敏度較高（10-9g）； 應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可

12、用于梯度洗脫。 定量基礎(chǔ)：Lambert-Beer定律，AKbc 高效液相色譜詳解郝建濤29 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波 長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。 檢測器簡介（二）檢測器簡介（二） 高效液相色譜詳解郝建濤30 熒光檢測器（fluorescence detector） （FLD） 原理：某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后 能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)檢 測。 特點(diǎn)：選擇性檢測器、靈敏度高 （10-12g）、對流量和溫度敏感 性低。 對多環(huán)芳烴，維生素B

13、、黃曲 霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥 物、氨基酸、甾類化合物等有響 應(yīng)。 檢測器簡介（三）檢測器簡介（三） 高效液相色譜詳解郝建濤31 檢測器簡介（四）檢測器簡介（四） 蒸發(fā)光散射蒸發(fā)光散射檢測器（檢測器（ELSDELSD） 原理：通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。色譜 柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵?霧狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，含溶 質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢 測器。在檢測器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大 小與數(shù)量。 特點(diǎn)：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高， 是通用型檢測器。 高效液相色譜詳解郝建濤32

14、檢測器簡介（五）檢測器簡介（五） 電導(dǎo)電導(dǎo)檢測器（檢測器（ECDECD） 原理：監(jiān)測溶液的電導(dǎo)率變化的檢測器。 特點(diǎn)：選擇性檢測器、測量時要求恒溫、對流動相的組 成變化有明顯響應(yīng)、靈敏度低（10-3g）。適用于離子型 化合物。 示差示差折光指數(shù)折光指數(shù)檢測器（檢測器（RIDRID） 原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液 的折射率之差來測量試樣濃度的檢 測器。 特點(diǎn)：通用性檢測器，溫變化要保 持在0.001、靈敏度低（10-6g） 高效液相色譜詳解郝建濤33 二、上機(jī)操作前，我們 需要準(zhǔn)備好什么？ 如：樣品怎么處理？ 流動相怎么選？ 儀器參數(shù)怎么設(shè)置？ 高效液相色譜詳解郝建濤34 1樣品的前處理樣品的

15、前處理 v 最好使用流動相溶解樣品。 v 使用預(yù)處理除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填 料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。 v 使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。 高效液相色譜詳解郝建濤35 樣品準(zhǔn)備 樣品完全溶解在流動相中樣品沒有完全溶解 過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒 用流動相或比流動相弱的溶劑溶解樣品 進(jìn)樣量盡量小 高效液相色譜詳解郝建濤36 樣品過濾頭的類型樣品過濾頭的類型： v30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩 種規(guī)格材料有，纖維素，醋酸纖維，聚四氟乙烯。處理樣 品體積少于50l。 v13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m和0.45m兩種 規(guī)格。 v3mm內(nèi)徑：

16、適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩 種規(guī)格。處理樣品體積為7l。 高效液相色譜詳解郝建濤37 濾膜類型濾膜類型： v聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何 可溶物。 v醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶 液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。 v尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用 于強(qiáng)酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。 v再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣 品和有機(jī)溶劑。 高效液相色譜詳解郝建濤38 v注意：1：每張濾膜只能用一次。 2：水相和有機(jī)相不要搞混。 高效液相色譜詳解郝建濤39 高效液相色譜詳解郝建濤40 2流

17、動相的配制流動相的配制 v 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組 分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。 v 流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng) v 流動相的黏度要盡量小 分離效果好 柱壓低，延長液體泵的使用壽命 (可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度) 高效液相色譜詳解郝建濤41 v流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如 使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑 配制。 v流動相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致 實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。 v在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。 高效液相色譜詳解郝建濤42 準(zhǔn)備流動相準(zhǔn)備流動相 高效液相色譜詳解

18、郝建濤43 1) 色譜級純或優(yōu)級純乙腈或甲醇 水超純水，18.2Mcm 高效液相色譜詳解郝建濤44 過濾裝置 高效液相色譜詳解郝建濤45 為什么要過濾？ 1、對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用 v色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小， 溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容 易堵塞。 v儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的 堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞 桿和活塞的磨損。 2、消除由于污染對分析結(jié)果的影響 高效液相色譜詳解郝建濤46 3) 溶劑準(zhǔn)備：脫氣溶劑準(zhǔn)備：脫氣 高效液相色譜詳解郝建濤47 目目 的的 流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解 氣體。 v 以防止在

19、洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測 器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的 噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。 v 溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱 中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。 v 若用FLD，可能會造成熒光猝滅。 高效液相色譜詳解郝建濤48 常用的脫氣方法常用的脫氣方法 v氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦 脫氣，效果較好，但成本高。 v加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。 v抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 v超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10- 15min，此法效果最差。 v在線真空脫氣法：Agilent1100

20、LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明 顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。 高效液相色譜詳解郝建濤49 3、流動相流速的選擇、流動相流速的選擇 v具體根據(jù)色譜柱的內(nèi)徑選擇 柱子的內(nèi)徑（5m填料）流速（ml/min） 4.61 - 2 3.00.4 - 0.8 2.10.2 - 0.4 1.00.05 - 0.09 高效液相色譜詳解郝建濤50 4、波長選擇、波長選擇 v首先在可見紫外分光光度計(jì)上測量樣品液的 吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈 敏的測量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫 外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值， 如吸收度小于0

21、.5時，HPLC測定的面積將會 很小。 高效液相色譜詳解郝建濤51 5記錄時間記錄時間 v第一次測定時，應(yīng)先將空白溶劑、對照品溶 液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長 時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣 品中被分析組分峰的位置、分離度及是否還 有雜質(zhì)峰在較長時間內(nèi)才洗脫出來，確定是 否會影響主峰的測定。 高效液相色譜詳解郝建濤52 三、三、Agilent 1100 機(jī)器操作機(jī)器操作 高效液相色譜詳解郝建濤53 1、檢查流動相、檢查流動相 vPurge閥（清洗閥、排液閥）處于松開狀態(tài) 高效液相色譜詳解郝建濤54 Purge閥 逆時針打開清洗閥 順時針關(guān)閉清洗閥 毛細(xì)管出口,流向進(jìn)樣器 廢

22、液管,清洗閥打開 時溶劑由此流向廢液 瓶. 高效液相色譜詳解郝建濤55 1、檢查流動相 vPurge閥（清洗閥、排液閥）處于松開狀態(tài) v把流動相放入溶劑瓶中，且濾頭浸入到液面下 A 水 B 甲醇 C 乙腈 D 緩沖液 高效液相色譜詳解郝建濤56 2、沖洗管路、沖洗管路 v選擇流動相為10異丙醇90水 （按此比例配好溶液后存放在礦泉水瓶中） 調(diào)節(jié)流速大約為1d/3s。 高效液相色譜詳解郝建濤57 3、打開電腦，等待、打開電腦，等待TAP窗口出現(xiàn)窗口出現(xiàn) 高效液相色譜詳解郝建濤58 4、打開、打開1100各模塊開關(guān)各模塊開關(guān) 高效液相色譜詳解郝建濤59 指示燈狀態(tài)指示燈狀態(tài) 每個部件接通電源后 L

23、ED燈顯示綠色 關(guān)機(jī) power off 準(zhǔn)備進(jìn)樣 power on 沒準(zhǔn)備好Not Ready 運(yùn)行Run 故障Error 駐留Resident Blink 儀器LED 狀態(tài)顯示 電源開關(guān)顯示 黑Black 黑Black 黃Yellow 綠Green 紅Red 黃閃爍Yellow blinking 6種LED儀器狀態(tài)： 高效液相色譜詳解郝建濤60 5、待、待1100自檢完畢，雙擊自檢完畢，雙擊online，啟動，啟動 工作站工作站 化學(xué)工作站自動與化學(xué)工作站自動與1100LC通訊，進(jìn)入工通訊，進(jìn)入工 作站畫面。作站畫面。 高效液相色譜詳解郝建濤61 高效液相色譜詳解郝建濤62 其它功能菜單

24、文件處理運(yùn)行控制 儀器控制序列放棄任務(wù)在線幫助 工作站任務(wù)切 換快捷鍵 方法存取快捷鍵方法存取快捷鍵序列存取快捷鍵 運(yùn)行方法運(yùn)行序列 高效液相色譜詳解郝建濤63 面對工作站，我該怎么辦？ What should I do？ v我們知道要運(yùn)行樣品需要設(shè)置控制儀器的參數(shù)，比如泵流速、流動 相比例、柱溫、檢測器波長、樣品校正等； v在Agilent化學(xué)工作站中我們把儀器控制和數(shù)據(jù)分析以及儀器相關(guān)的 運(yùn)行等所有參數(shù)稱為一個方法Method； v所以要運(yùn)行一個樣品，首先要得到一個正確的方法； v在Agilent化學(xué)工作站中要得到方法要么調(diào)用一個已經(jīng)存在的方法， 要么自己編輯一個新的方法； v一般來說，通

25、過查閱資料比如國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、藥典、專業(yè)技 術(shù)資料、EPA等都可以得到樣品分析的詳細(xì)方法； v您需要做的就是把這些方法在Agilent化學(xué)工作站中建立起來，然后 運(yùn)行儀器并得到數(shù)據(jù)。 高效液相色譜詳解郝建濤64 6、方法的編輯、方法的編輯 高效液相色譜詳解郝建濤65 1）調(diào)用方法 在Method中點(diǎn)擊Load Method 工作站彈出下面對話框. 在右面對話框中選中要調(diào)用的方法名, 點(diǎn)擊“OK”,該方法即被激活. 高效液相色譜詳解郝建濤66 使用 Edit Entire Method 編輯一個完整的方法 2）編輯一個新方法 高效液相色譜詳解郝建濤67 選擇所要編輯的內(nèi)容 畫面1:方法組成

26、在你想要的部分前選中,否則方法 里將不包括該部分的內(nèi)容。比如本 方法不包括數(shù)據(jù)分析的內(nèi)容。 方法信息 儀器控制與數(shù)據(jù)采集 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)行時間表 高效液相色譜詳解郝建濤68 方法信息 (Method Information) 畫面2：方法信息 輸入您想要對方法的說明，比如方法的 用途、來源等信息。 高效液相色譜詳解郝建濤69 包括：流量(Flow)，流動相組成(Solvents)，停止采集時間(Stop Time)，梯度 編程(Timetable)，壓力限制設(shè)定(Pressure Limits) 泵的操作參數(shù) 壓力限制：Max 最高壓力，Min 最低壓力 流動相梯度表 輸入流量(Flow) 輸入

27、停止采集時 間(Stop Time) 輸入流動相組成，B、C、D 可輸，A=100-B-C-D 輸入流動相名稱 畫面3：泵參數(shù) （四元泵） 高效液相色譜詳解郝建濤70 檢測器參數(shù)設(shè)置 畫面5：檢測器參數(shù) VWD 輸入使用的波長 高效液相色譜詳解郝建濤71 l控溫范圍：低于室溫1080 l兩個單獨(dú)的加熱區(qū)。 l安裝切換閥可以進(jìn)行柱切換。 l可以容納30 cm長色譜柱。 l安裝柱識別可以自動記錄進(jìn)樣次數(shù)。 柱溫箱 畫面6：恒溫柱箱參 數(shù)設(shè)置 輸入控制溫度 溫度編程表 高效液相色譜詳解郝建濤72 從Method菜單選擇Save Method / Save Method as或從存貯方法工具圖標(biāo)存貯方

28、法。 存貯方法 換名保存 覆蓋保存 另存時在此處輸入方法名 高效液相色譜詳解郝建濤73 7、樣品的測定 高效液相色譜詳解郝建濤74 要分析單個樣品, 從RunControl菜單選擇 Sample Info., 輸入樣品信息。樣品信息包括 ：操作者姓名(Operator Name)，存盤數(shù)據(jù)文件(Data File)，樣品參數(shù)(Sample Parameters)。然后運(yùn)行方法(Run Method)。 指定樣品瓶號及數(shù)據(jù)路徑 樣品瓶所放位置 子目錄名稱 數(shù)據(jù)形式Manual為手動， Prefix/Counter為自動累加。 高效液相色譜詳解郝建濤75 從從Instrument 菜單選擇菜單選擇

29、System on。 鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊紅色或藍(lán)色標(biāo)題，即可將Y 軸顯示成對應(yīng)的相應(yīng)值和單位 高效液相色譜詳解郝建濤76 8、數(shù)據(jù)分析 v從“View ”菜單中，單擊“Data analysis”進(jìn) 入數(shù)據(jù)分析畫面 v從“File ”菜單選擇“Load signal ” ，選中 您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。 高效液相色譜詳解郝建濤77 調(diào)用信號文件 疊放多個信號文件 高效液相色譜詳解郝建濤78 v做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇 “Signal options ”選項(xiàng)。從Ranges中選擇 Auto scale及合適的顯示時間，單擊ok，或選 擇”Use Ranges ”調(diào)整。

30、反復(fù)進(jìn)行，直到圖 的比例合適為止。 圖形優(yōu)化 高效液相色譜詳解郝建濤79 圖形優(yōu)化 Signal Options 信號選項(xiàng) 高效液相色譜詳解郝建濤80 積積 分分 v 從“Integration ”中選擇 “Auto integrate ”， 如積分結(jié)果不理想，再從菜單中選擇 “Integration Events ”選項(xiàng)，選擇合適的 Slope sensitivity，Peak width，Area reject， Height reject。 高效液相色譜詳解郝建濤81 積分參數(shù)優(yōu)化 Integration Events 積分參數(shù)選項(xiàng)（及快捷鍵） 高效液相色譜詳解郝建濤82 積分參數(shù) Sl

31、ope Sensitivity 設(shè)置斜率靈敏度，截除噪音積分 Peak Width 設(shè)置半峰寬度，遠(yuǎn)大于或小于該數(shù) 值的峰的積分將被截除 Area Reject 設(shè)置面積截除，截除面積低于此值 的峰的積分 Height Reject 設(shè)置峰高截除 Shoulders 設(shè)置肩峰參數(shù) 高效液相色譜詳解郝建濤83 這是一張優(yōu)化了積分參數(shù)的譜 圖積分，噪音及雜質(zhì)積分已被 截除。 高效液相色譜詳解郝建濤84 9、打印報(bào)告 10、回到Method and Run control 可繼續(xù)測量 高效液相色譜詳解郝建濤85 11、關(guān)機(jī) v1）沖洗管路和色譜柱30min A：水 B：甲醇 （如果使用了D緩沖溶液，

32、則用一干凈小燒杯盛放 超純水） 流速：5ml/min 高效液相色譜詳解郝建濤86 v2）用甲醇2030ml沖洗進(jìn)樣閥 v3）關(guān)閉工作站 v4）關(guān)閉TAP窗口 v5）關(guān)1100的電源 v6）關(guān)電腦 v7）在大型儀器使用記錄本上登記 v8）關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的水、電、氣及門窗等 高效液相色譜詳解郝建濤87 小結(jié)：液相色譜操作步驟小結(jié)：液相色譜操作步驟 v倒入流動相，裝柱 v開機(jī)：計(jì)算機(jī)Bootp 開設(shè)備 v打開Chemstation工作站 v創(chuàng)建（調(diào)用）方法 v排氣：打開排氣閥，先排有機(jī)相、再排無機(jī)相，5ml/min v流速調(diào)至0.1ml/min，擰緊排氣閥。 v平衡柱子：梯度升速至最終流速，基線平直10

33、15min v系統(tǒng)平衡后點(diǎn)擊“start”開始進(jìn)樣 v操作結(jié)束：10%有機(jī)相+90%水洗柱0.5h；再用純有機(jī)相洗 0.51h；梯度降速至0ml/min v關(guān)機(jī)、卸柱子 高效液相色譜詳解郝建濤88 四、常見故障排除四、常見故障排除 高效液相色譜詳解郝建濤89 液相色譜儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不同型號的色譜儀，出故障時產(chǎn)生液相色譜儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不同型號的色譜儀，出故障時產(chǎn)生 的現(xiàn)象有可能不同，以下羅列的現(xiàn)象僅供參考的現(xiàn)象有可能不同，以下羅列的現(xiàn)象僅供參考： 現(xiàn) 象原 因排除方法 1.柱前導(dǎo)管接頭 漏液 2.泵柱室內(nèi)有大 量氣泡存在 3.貯液瓶內(nèi)試劑 用完 4.輸液泵未工作 1.檢查各接口是 否有漏液； 2

34、.放開泵出口接 頭；用“清洗” 鍵沖洗泵體； 3.添加流動相； 4.按輸液泵操作 方法，檢查其工 作狀態(tài)。 高效液相色譜詳解郝建濤90 常常 見見 故故 障障 排排 除除 現(xiàn) 象原 因排除方法 1.分離柱阻力過大(陳 舊柱子) 2.柱前導(dǎo)管堵塞 3.泵柱塞內(nèi)有少量氣 泡存在 4.柱子進(jìn)口處過濾膜 堵塞 5.進(jìn)樣閥手柄未旋到 底(處于中間狀態(tài)) 6.導(dǎo)管中有顆粒狀固 體堵塞 1.更換柱子 2.從柱后開始逐級向 上拆開接頭檢查 3.拆開泵接頭，用“清 洗”檔趕盡氣泡。 4.拆開柱前接頭、更換或 清洗過濾膜 5.左右旋動六通閥至極限 位置 6.逐級檢查，并更換導(dǎo)管 高效液相色譜詳解郝建濤91 常常

35、見見 故故 障障 排排 除除 現(xiàn) 象原 因排除方法 1.流動相中存在大顆 粒的物質(zhì) 2.樣品未經(jīng)過過濾處 理 3.柱子輸入端濾片污 染 1.流動相經(jīng)5m的 真空抽濾瓶過濾后再 使用 2.樣品須經(jīng)濾膜過濾 3.拆下柱的濾片用超聲 波清洗，同時刮去柱口 表面被污染的固定相 1.流通池內(nèi)留有大量 的氣泡 2.流通池漏液 3.紫外檢測器有故障 1.排除氣泡 2.檢修流通池 3.停止恒流泵工作，檢 查紫外檢測器 高效液相色譜詳解郝建濤92 現(xiàn) 象原 因排除方法 1.波長選擇不正確 2.檢測器輸出衰減 太大 3.進(jìn)樣口漏液 4.進(jìn)樣閥樣品廢液管 堵塞，樣品未進(jìn)入 定量管 5.進(jìn)樣后未按啟動鍵 6.定量管容

36、積過小 7.樣品濃度過稀 8.檢測器燈源老化或 失效 9.流動相不純 1.按標(biāo)準(zhǔn)重新選擇波長 2.重新選擇輸出量程范圍 3.修理進(jìn)樣閥 4.拆下六通閥上廢液管(5# ，6#)重新安裝 5.進(jìn)樣后立即按啟動鍵 6.更換大容量定量管 7.濃縮樣品后再進(jìn)樣 8.更換燈源 9.選擇高純度的流動相 高效液相色譜詳解郝建濤93 常常 見見 故故 障障 排排 除除 現(xiàn) 象原 因排除方法 1.設(shè)置溫度值過低 2.柱箱密封蓋未蓋好 3.溫度控制器未啟動 4.柱箱升過高溫后， 再設(shè)置低溫 5.溫控部件有故障 6.控溫鉑電阻接觸 不良 1.設(shè)置最低溫度應(yīng) 室溫以上10 2.檢查柱安裝過程 3.按 起始 鍵(指示燈

37、亮) 4.開機(jī)后會逐漸穩(wěn)定 (正?，F(xiàn)象) 5.修理溫度控制器 6擰緊固定鉑電阻引 線的螺釘 高效液相色譜詳解郝建濤94 常常 見見 故故 障障 排排 除除 現(xiàn) 象原 因排除方法 檢測器開機(jī)時 屏幕 顯示不正 常，出現(xiàn)缺 字、坐標(biāo)圖形 異樣、光標(biāo)無 法移動等現(xiàn)象。 工作電源不正常 或儀器附件有強(qiáng) 干擾源存在。 1.檢查工作電源電壓， 采取穩(wěn)壓措施 2.關(guān)機(jī)后重新開機(jī) 3.檢測器微機(jī)系統(tǒng)故障 高效液相色譜詳解郝建濤95 常見圖譜分析常見圖譜分析 由于液相色譜儀在工作中受到的影響因素較多，因此出現(xiàn) 的色譜圖形也較為復(fù)雜，除與操作者的使用和儀器所處的 環(huán)境有關(guān)外，還與分離柱、流動相性質(zhì)、分析對象的性質(zhì)

38、 、所選擇的工作條件有關(guān)?，F(xiàn)僅對與儀器性能有關(guān)的常見 圖譜作一粗略分析，供參考。 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除 1.環(huán)境溫度變化過大環(huán)境溫度變化過大 2.液流不穩(wěn)定或有漏液液流不穩(wěn)定或有漏液 3.在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi)在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi) 1.避開室內(nèi)通風(fēng)口位避開室內(nèi)通風(fēng)口位 置和發(fā)熱或制冷源置和發(fā)熱或制冷源 2.觀察泵的工作狀態(tài)觀察泵的工作狀態(tài), 并查漏并查漏 3. 110-4Au 高效液相色譜詳解郝建濤96 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除 1.外界干擾訊號外界干擾訊號 2.輸液泵柱室內(nèi)有氣泡輸液泵柱室內(nèi)有氣泡 3.流通池內(nèi)有氣泡流通池內(nèi)有氣泡 1.使

39、機(jī)殼良好接地，使機(jī)殼良好接地， 排除附近干擾源排除附近干擾源 2.用用“清洗清洗”鍵或排鍵或排 放閥排除氣泡放閥排除氣泡 3.拆下輸入導(dǎo)管，大拆下輸入導(dǎo)管，大 流量沖洗池體或在流量沖洗池體或在 池體出口增加阻力池體出口增加阻力 (接長排液導(dǎo)管接長排液導(dǎo)管) 漂移漂移 1.儀器在穩(wěn)定中儀器在穩(wěn)定中 2.在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi)在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi) 3.柱箱升過高溫后，柱箱升過高溫后， 再處于室溫工作再處于室溫工作 4.檢測器工作不穩(wěn)定檢測器工作不穩(wěn)定 1.正?，F(xiàn)象正常現(xiàn)象 2.屬正常狀態(tài)屬正常狀態(tài) 3.將分離柱從柱箱將分離柱從柱箱 內(nèi)取出后使用內(nèi)取出后使用 4.元器件工作點(diǎn)不穩(wěn)元器件工作點(diǎn)不穩(wěn) 定，修理后再

40、使用定，修理后再使用 高效液相色譜詳解郝建濤97 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除 1.組份分離不佳組份分離不佳 a.色譜柱選擇有誤色譜柱選擇有誤 b.流動相不符合分析要求流動相不符合分析要求 c.柱后導(dǎo)管過長柱后導(dǎo)管過長 2.波長選擇不正確波長選擇不正確 3.流速過大流速過大 1.重疊峰重疊峰 a.更換色譜柱更換色譜柱 b.重新選擇流動相重新選擇流動相 c.盡可能減短柱后導(dǎo)管長度盡可能減短柱后導(dǎo)管長度 2.重選波長，增大組重選波長，增大組 份的吸光度差異份的吸光度差異 3.減小流量值減小流量值 1流動相已用完流動相已用完 2溫度控制器失控溫度控制器失控 (恒溫開啟條件下

41、恒溫開啟條件下) 3在工作過程添加在工作過程添加 流動相流動相 1.突然漂移大多為突然漂移大多為 流動相用完造成流動相用完造成 2.檢查溫度控制器檢查溫度控制器 3.盡可能不要在工作盡可能不要在工作 時加流動相，可采用時加流動相，可采用 較大的貯液瓶較大的貯液瓶 高效液相色譜詳解郝建濤98 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除 1放大器量程選擇放大器量程選擇 過大過大 2放大器無輸出放大器無輸出 3二次儀表或檢測器二次儀表或檢測器 失效失效 1.減小量程范圍減小量程范圍(若接若接 積分儀，可減小儀積分儀，可減小儀 器的滿度電壓值器的滿度電壓值) 2. 未按起始鍵未按起始鍵 3.更換失效的部件更換失效的部件 基線無噪聲基線無噪聲 出倒峰出倒峰 1.組份吸光度小于流組份吸光度小于流