微生物實驗報告：測定細(xì)菌生長曲線

1、測定細(xì)菌生長曲線一、 實驗?zāi)康? 了解細(xì)菌生長曲線特征，測定細(xì)菌繁殖的代時；2 學(xué)習(xí)液體培養(yǎng)基的配制以及接種方法；3 反復(fù)練習(xí)無菌操作技術(shù)；4 了解不同細(xì)菌，不同接種方法在同一培養(yǎng)基上生長速度的不同；5 掌握利用細(xì)菌懸液混濁度間接測定細(xì)菌生長的方法；二、 實驗原理將一定量的菌種接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定的條件下培養(yǎng)，可觀察到細(xì)菌的生長繁殖有一定規(guī)律性，如以細(xì)菌活菌數(shù)的對數(shù)做縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間做橫坐標(biāo)，可繪成一條曲線，稱為生長曲線。單細(xì)胞微生物發(fā)酵具有4個階段，即調(diào)整期（遲滯期）、對數(shù)期（生長旺盛期）、平衡期（穩(wěn)定期）、死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細(xì)菌從開始生長到死亡的的全過程動態(tài)。不同微生

2、物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血細(xì)胞計數(shù)法，平板菌落計數(shù)法，稱重法和比濁法。本實驗才用比濁法，由于細(xì)胞懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可以利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的菌液的濃度。將所測得的光密度值（od600）與對應(yīng)的培養(yǎng)時間做圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌和死菌，因此所測生長曲線的衰亡期不明顯。從生長曲線我們可以算出細(xì)胞每分裂一次所需要的時間，即代時，以g表示，其計算公式為：

3、g（t2-t1）/(lgw1-lgw2)/lg2式中t2和t1為所取對數(shù)期兩點(diǎn)的時間，w1和w2分別為對應(yīng)時間測得的細(xì)胞含量或od。三、 實驗器材 大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板； 培養(yǎng)基(100ml/250ml三角瓶10瓶/大組):牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基； 取液器(5000ul, 1000ul 各一支)，無菌1000ul吸頭若干，無菌5000ul吸頭若干，比色皿10個及共用參比杯一個，培養(yǎng)箱3臺，722s分光光度計；四、 實驗步驟1 活化菌種 將細(xì)菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)18h，另外準(zhǔn)備單菌落平板各1塊；2 接種6人大組分為3個小組，按表1接種。表1.各培養(yǎng)基接

4、入菌種及培養(yǎng)條件編號接入菌種培養(yǎng)條件0放置在實驗臺上做對照第1小組11.0ml大腸桿菌菌液37 200rpm23.0ml大腸桿菌菌液37 200rpm35.0ml大腸桿菌菌液37 200rpm第2小組4一個大腸桿菌菌落37 200rpm51.0ml大腸桿菌菌液37 110rpm61.0ml大腸桿菌菌液30 200rpm第3小組71.0ml枯草桿菌菌液37 200rpm81.0ml枯草桿菌菌液30 200rpm91.0ml枯草桿菌菌液37 110rpm3 培養(yǎng)并測量每培養(yǎng)一小時取樣一次：取500ul培養(yǎng)液到2000ul蒸餾水中，以蒸餾水為對照，測od600，固定參比杯，不要調(diào)動波長旋鈕；固定一臺

5、分光光度計; 零小時也要測。全班同時取樣,同時開始振蕩, 取樣期間時間不算。培養(yǎng)開始時，測0號瓶ph。實驗結(jié)束后，測19號瓶ph。五、 結(jié)果1.od600od600記錄結(jié)果見表2。表2. 發(fā)酵過程od600測量值。劃線結(jié)果表示明顯錯誤，作圖時棄去；綠色表示用于計算代時。發(fā)酵時間/小時0.00 0.98 2.17 2.73 3.31 3.95 4.55 5.67 6.78 7.93 8.98 10.07 編號od600（除0小時外均是測量值減基準(zhǔn)值）10.032 -0.030 0.156 0.233 0.301 0.249 0.309 0.312 0.309 0.315 0.317 0.317

6、20.123 -0.031 0.163 0.217 0.284 0.226 0.285 0.267 0.277 0.284 0.287 0.274 30.141 -0.008 0.191 0.253 0.280 0.225 0.163 0.213 0.292 0.297 0.286 0.256 4-0.021 -0.026 -0.022 -0.031 -0.029 -0.088 -0.020 0.044 0.224 0.344 0.371 0.365 5-0.012 0.029 0.184 0.224 0.255 0.203 0.269 0.259 0.250 0.239 0.254 0.20

7、6 6-0.013 0.003 0.089 0.173 0.258 0.270 0.317 0.409 0.415 0.415 0.383 0.401 70.002 -0.040 -0.039 0.153 0.344 0.021 0.062 0.194 0.242 0.297 0.372 0.427 8-0.007 -0.027 -0.034 0.166 0.318 -0.023 -0.008 0.052 0.107 0.199 0.277 0.337 9-0.008 -0.034 -0.018 0.189 0.397 -0.020 0.069 0.245 0.288 0.285 0.372

8、0.412 對各組數(shù)據(jù)做生長曲線圖，可得圖1。abcdefghi圖1.生長曲線。ai圖分別繪出19號培養(yǎng)瓶的od600發(fā)酵時間曲線，每幅圖上方小標(biāo)題表示該圖的培養(yǎng)條件。gi組2.7和3.3小時數(shù)據(jù)明顯錯誤，未繪入圖。2ph 對照組初始ph7.0， 用實驗室的兩種試紙：6.48.0，4.05.0，各實驗組均未測出準(zhǔn)確ph值?？磥韕h都處在5.06.4之間，精確值未知。3代時計算根據(jù)表1中的紅色數(shù)字對應(yīng)的時間及od600，我們用公式： g（t1-t2）/(lgw1-lgw2)/lg2來計算各瓶的代時。計算結(jié)果見表2。表2.各發(fā)酵條件下的代時t1/ht2/hw1w2代時g/min12.172.730

9、.1560.23358.122.172.730.1630.21781.432.172.730.1910.25382.845.676.780.0440.22428.452.172.730.1840.224118.462.172.730.0890.17335.074.555.670.0620.19440.886.787.930.1070.19977.194.555.670.0690.24536.8 理論上，大腸桿菌代時為37min，枯草桿菌代時為25min，我們的計算結(jié)果還與之相去甚遠(yuǎn)。原因主要是培養(yǎng)條件不行，不是連續(xù)發(fā)酵，沒有營養(yǎng)補(bǔ)充，而且細(xì)菌生長時經(jīng)常被我們“打擾”，不能一直保持高速生長狀態(tài)。

10、而且我們都是用原始數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行計算的，可能會有較大偏差?？梢岳密浖ιL曲線進(jìn)行擬合，得到平滑的s型曲線再計算?？上覜]有相關(guān)軟件，只好湊活用excel。 六、 討論 從上面的實驗結(jié)果可以看出，不同菌種、不同溫度、不同轉(zhuǎn)速條件下，發(fā)酵的生長曲線和代時有很大差異。下面我們分別對這些影響因素進(jìn)行討論。1 溫度我們選取培養(yǎng)瓶1號和6號、7號和8號分別做對比，在同一張圖內(nèi)做生長曲線(圖2)。不同溫度下大腸桿菌的生長曲線不同溫度下枯草桿菌的生長曲線圖2.溫度對于生長曲線的影響。上圖菌種為大腸桿菌，下圖菌種為枯草桿菌。除溫度外，其余條件均一樣。由圖可以看出，大腸桿菌在37條件下調(diào)整期較短，迅速進(jìn)入對數(shù)期。

11、在30條件下，調(diào)整期、對數(shù)期均有明顯增長，穩(wěn)定期到來較晚，且維持在一個較高的水平上?？梢哉J(rèn)為37更利于大腸桿菌的生長，30條件下細(xì)菌需要更長的時間來適應(yīng)溫度。但是比較代時發(fā)現(xiàn)，37的代時要長于30，這與生長曲線數(shù)據(jù)矛盾，可能是od600測量中的微小誤差積累起來所致，下面將討論。而在枯草桿菌中，37的調(diào)整期較短，代時也短于30。說明37更利于枯草桿菌生長。2 轉(zhuǎn)速我們選取培養(yǎng)瓶1號和5號、7號和9號分別做對比，在同一張圖內(nèi)做生長曲線(圖3)。不同轉(zhuǎn)速下大腸桿菌的生長曲線不同轉(zhuǎn)速下枯草桿菌的生長曲線圖3.轉(zhuǎn)速對于生長曲線的影響。上圖菌種為大腸桿菌，下圖菌種為枯草桿菌。除轉(zhuǎn)速外，其余條件均一樣。 從

12、圖3看出，轉(zhuǎn)速對于調(diào)整期和對數(shù)期沒有太大影響，但是高轉(zhuǎn)速帶來的高溶氧可以顯著縮短大腸桿菌的代時。大腸桿菌是兼性厭氧，在高溶氧條件下生長較快，在低溶氧條件下也可生長，只是速度較慢而已。對于枯草桿菌，從生長曲線、代時上看都沒有顯著改變。但是枯草桿菌是需氧菌，理論上講應(yīng)該高轉(zhuǎn)速有利生長?？赡苁且驗檎袷幾饔貌蛔阋允谷苎踉黾拥接绊懣莶輻U菌生長的闕值，或是低轉(zhuǎn)速已經(jīng)足夠提供其快速生長所需氧氣。3 細(xì)菌種類 我們選取培養(yǎng)瓶1號和7號、5號和9號、6號和8號分別做對比，在同一張圖內(nèi)做生長曲線(圖4)。圖4.各個培養(yǎng)條件下大腸桿菌和枯草桿菌的生長曲線對比。溫度、轉(zhuǎn)速表于每幅圖上方。 由圖4可以看出，在各個培養(yǎng)條

13、件下，枯草桿菌的調(diào)整期均明顯長于大腸桿菌，而對數(shù)期也要長于大腸桿菌，代時較短。說明大腸桿菌能夠很快地適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，快速生長，而枯草桿菌調(diào)整能力較弱，但生長能力較強(qiáng)。4 菌種狀態(tài)我們選取培養(yǎng)瓶1號和4號，在同一張圖內(nèi)做生長曲線(圖5)。圖5.大腸桿菌不同菌種狀態(tài)的生長曲線對比。培養(yǎng)條件為37，200rpm。從圖5可以明顯看出，固體菌種的調(diào)整期約為5個小時，遠(yuǎn)長于液體菌種（約為1個小時），可能原因是固體菌種需要一定時間來分散到培養(yǎng)基中，以免局部過濃發(fā)生種內(nèi)競爭。但是可能是因為固體菌種里菌數(shù)較多，生長起來速度非?？?，其代時很短，而且對數(shù)期較長，如果繼續(xù)發(fā)酵的話可能會達(dá)到很高的穩(wěn)定期平臺。5 菌種數(shù)量

14、 我們選取培養(yǎng)瓶1號、2號和3號，在同一張圖內(nèi)做生長曲線(圖6)。圖6.大腸桿菌不同菌種數(shù)量的生長曲線對比。培養(yǎng)條件為37，200rpm。 從圖6的3條曲線可以看出，不同接種量對生長曲線沒有什么影響，而代時也沒有顯著改變。唯一的不同是基礎(chǔ)od600值有所差別，接種量越大，初始o(jì)d600值也越大?？墒抢碚撋现v接種量越大，生長會越快。至于為什么不符合理論，可能是因為菌種活性的問題，盡管接種量大但活性沒有相應(yīng)的成正比提高。6 od600測量 按照要求，各組要使用固定的分光光度計和比色杯，連參比杯也不能換，這是為了 減小系統(tǒng)誤差而采取的措施。這點(diǎn)我們做的很好，但是在分光光度計的使用上犯了錯誤。在表2中

15、可以看出有一些數(shù)據(jù)明顯不符合生長曲線，在測量時很有可能是沒有對準(zhǔn)光路，用光柵去擋了光，而我們還以為是已經(jīng)開始生長，沒有在意。所以就繼續(xù)實驗下去，沒有重新校正、測量。直到后來發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)又降下去重新開始增長才發(fā)現(xiàn)當(dāng)時的錯誤，可惜沒辦法補(bǔ)救了，只好把那幾組數(shù)據(jù)作廢。 除了光路的影響，還有取樣的影響。雖然培養(yǎng)瓶在搖床中不斷振蕩，成分混合的比較均勻，但在取出后到取樣前的一段時間里（約2min）還是有可能沉降造成測量誤差的。所以吸之前也要用無菌槍頭吹打均勻，測之前再吹打一次。另外，分光光度計本身是有一定精度范圍的，0.05以內(nèi)的偏差可以接受。所以如果眾多數(shù)據(jù)均在0.05范圍內(nèi)波動，可以認(rèn)為是相同的。但是如果

16、用于計算代時的數(shù)據(jù)一個取0.05，一個取0.05，算出來的代時就會有很大偏差了。這也解釋了為什么代時計算結(jié)果和預(yù)期有不符合的地方。7 取樣時間取樣時間要盡量短，讓細(xì)菌有一個穩(wěn)定地生長環(huán)境，才能得到短代時、高產(chǎn)量的結(jié)果。我們的取樣開始時間和結(jié)束時間記錄見表4。表4.各取樣時間及中斷培養(yǎng)時間記錄發(fā)酵時間/h0.00 0.98 2.17 2.73 3.31 3.95 4.55 5.67 6.78 7.93 8.98 10.07 開始取樣時間9:4010:4911:5912:3413:0913:4714:2315:3016:3717:4618:4919:54結(jié)束取樣時間9:5010:5212:0212

17、:3713:1113:5114:2615:3216:4017:4818:5119:56開始培養(yǎng)時間9:5011:0012:0512:4013:1813:5514:3115:3816:4717:5118:56由表中數(shù)據(jù)可見，我們的間斷培養(yǎng)時間多為810分鐘，這相對于1小時的發(fā)酵時間來說占了不小比例。較長時間處在不太適合生長的低溫（室溫約25度）、低溶氧（無振蕩）環(huán)境中，這對快速生長中的細(xì)菌的影響無異于高速行駛中的汽車猛踩剎車。細(xì)菌需要一段時間來重新進(jìn)入快速生長狀態(tài)。這大大增長了代時。因此我們要全班有序、配合，最好能在5分鐘內(nèi)取完樣，使中斷時間盡可能的短。推薦在即將取樣前點(diǎn)燃酒精燈，在比色皿中預(yù)加

18、稀釋用的2ml水，拿出樣品后一起解開皮筋，逐一取樣。之后立即封口，放回培養(yǎng)箱，再去測od600。8 無菌操作 盡量避免雜菌污染。雖說相對于培養(yǎng)瓶中大量的實驗菌來說，雜菌勢孤力單，競爭起來毫無優(yōu)勢，但是培養(yǎng)時間較長，多少都會影響實驗菌的生長，而且會消耗一部分培養(yǎng)基。每次取樣時都要在酒精燈火焰旁操作，同時注意不要燒到封口膜和移液器及槍頭。一旦封口膜被燒，沒有滅過菌的替代品，此瓶即報廢。希望以后做實驗時可以多準(zhǔn)備35張滅菌封口膜備用，要不然因為封口膜被燒而報廢一組數(shù)據(jù)，覺得非?？上АＦ?、 思考題1. 為什么可用比濁法來表示細(xì)菌的相對生長狀況？細(xì)胞懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可以利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的菌液的濃度，從而在一定程度上反應(yīng)細(xì)菌的相對生長狀況。 2. 生長曲線中為什么會有穩(wěn)定期和衰退期？平衡期：當(dāng)細(xì)胞繁殖的速度達(dá)到最高峰時，期細(xì)胞總量就不會再增加，是因為調(diào)整期、對數(shù)期糖類營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的積累以及培養(yǎng)基中ph值、氧化還原電勢的改變，對細(xì)胞產(chǎn)生了很大的抑制性。這時，細(xì)胞總數(shù)將處于穩(wěn)定狀態(tài)，死亡細(xì)胞數(shù)和繁殖細(xì)胞數(shù)處于平衡狀態(tài)。死亡期：平衡期后如果繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞總數(shù)不再穩(wěn)定，死亡細(xì)胞數(shù)將逐漸增加，死亡速度超過繁殖速度，使進(jìn)入死亡期。3. 什么條件下接種為宜？液體種子比固體種子有什么優(yōu)越性？從實驗結(jié)果可知，在細(xì)菌的最適溫度、溶氧條件下，接種適當(dāng)數(shù)量的對