雙向電泳技術PPT學習教案

1、會計學1雙向電泳技術雙向電泳技術2第1頁/共67頁3第2頁/共67頁4 在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時間內它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本原理。第3頁/共67頁5第4頁/共67頁6第5頁/共67頁7按支持介質種類的不同，區(qū)帶電泳可分為紙電泳：用濾紙作為支持介質，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效應，

2、主要靠被分離物的電荷多少進行分離。第6頁/共67頁8第7頁/共67頁9第8頁/共67頁10聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel electrophoresispolyacrylamidegel electrophoresis，簡稱PAGEPAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。PAGEPAGE應用廣泛，可用于蛋白質、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等。第9頁/共67頁111、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：幾乎無電滲作用?；瘜W性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應。對pHpH和溫度變化較穩(wěn)定。在一定濃度范圍內凝膠無色透明，有彈性，機械性能

3、好，易觀察。凝膠孔徑可調。分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而有更高的分辨率。第10頁/共67頁122、聚丙烯酰胺凝膠的聚合第11頁/共67頁13催化劑和加速劑的種類AP-TEMEDAP-TEMED：化學聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨( (簡稱AP)AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活AcrAcr單體，形成單體長鏈，在交聯(lián)劑BisBis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。核黃素-TEMED-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因為核黃素在TEMEDTEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形

4、成自由基，從而引發(fā)聚合作用。第12頁/共67頁14第13頁/共67頁15丙烯酰胺會產(chǎn)生如下幾個化學反應：高濃度酸和堿會促進其水解形成丙烯酸和NH3NH3。與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應，生成- -芳氧基或烷氧基丙酰胺。在2020能NH3NH3反應，生成、- -氮川三丙酰胺。與一些硫醇反應，生成- -烷基丙酰胺。也會由于超聲、- -射線和自然光線引起聚合作用。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。第14頁/共67頁16凝膠的孔徑可調性及其他性質每100100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%T%表示； T% = (a+b)/mT% = (

5、a+b)/ma a：丙烯酰胺克數(shù)；b b：N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m m：緩沖液體積( (毫升) )。3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：第15頁/共67頁17第16頁/共67頁18濃縮效應濃縮效應第17頁/共67頁19聚丙烯酰胺凝膠電泳的異常現(xiàn)象及解決辦法1.1.凝膠未聚合2.2.未加水層時凝膠聚合3.3.電泳后未能檢測出樣品4.4.樣品分離區(qū)帶寬或拖尾5.5.只顯一條區(qū)帶6.6.分離區(qū)帶呈條紋狀第18頁/共67頁20第19頁/共67頁21第20頁/共67頁22第21頁/共67頁232、聚焦效應3、等電聚焦的分辨率第22頁/共67頁24第23頁/共67頁252、載體兩性電解質pH梯度的

6、形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：用兩種不同的pH的緩沖液互相擴散，在混合區(qū)形成pH梯度。這種方法形成的pH梯度很不穩(wěn)定，重復性差，現(xiàn)已不使用。人工pH梯度。利用載體兩性電解質在電場作用下自然形成pH梯度，常用該方法。天然pH梯度。第24頁/共67頁26第25頁/共67頁27 固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。第26頁/共67頁281、固相pH梯度的介質 其所用的介質是一些具有弱酸或弱堿性質的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合

7、行為。第27頁/共67頁292、固相pH梯度的建立 固相pH梯度等電聚焦技術的突破要歸功于Immobilines試劑（Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基礎上開發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術。Immobilines（固相試劑）是一系列性質穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的聚合行為。每個分子都有一個單一的酸性或堿性緩沖基團與丙烯酰胺單連，其結構式為： 其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質中。所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。分子另一端的R基團為弱酸或弱堿性的緩沖基團，利用

8、緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH310范圍的緩沖體系。 所以固相pH梯度與載體兩性電解質pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。第28頁/共67頁30固相固相pHpH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質結合緩沖基團梯度聚丙烯酰胺凝膠基質結合緩沖基團第29頁/共67頁314、固相pH梯度的優(yōu)點和注意事項3、固相pH梯度等電聚焦原理 蛋白質分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，知道達到自己的等電點，停止遷移。 固相pH梯度可窄至pH0.1的范圍，因此分辨率極

9、高，可達0.001pH；pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率；重復性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾?。粚A性蛋白質也能很好的分離，無邊緣效應，故可用很窄的膠條（如5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相 pH梯度灌膠技術復雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時候需要高電壓，電泳時間長，窄范圍pH測定困難，只能計算。注意事項注意事項：溫度：20-30；電壓：梯度上升。第30頁/共67頁32加樣方式第31頁/共67頁33等等電電聚聚焦焦電電泳泳進進行行過過程程中中等等電電聚聚焦焦電電泳泳結結束束后后（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH第32頁/共67頁34第33頁

10、/共67頁35連續(xù)電泳不連續(xù)電泳濃縮效應凝膠層緩沖液離子成分pH電位梯度濃縮效應電荷效應分子篩效應第34頁/共67頁362、影響凝膠聚合的因素 形成凝膠試劑的純度 凝膠濃度 溫度和氧氣的影響：23-253、聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點第35頁/共67頁37第36頁/共67頁382、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響因素 溶液中SDS單體的濃度 二硫鍵是否完全還原 緩沖系統(tǒng)的選擇 凝膠濃度的選擇第37頁/共67頁39凝膠電泳的操作要點1.1.凝膠制備2.2.電極緩沖液3.3.樣品處理及加樣4.4.電泳5.5.染色與固定6.6.脫色7.7.分析第38頁/共67頁40？

11、pH值不對=第39頁/共67頁41第40頁/共67頁42第41頁/共67頁43二、流程（一）樣品制備（二）第一向：等電聚焦 1、加樣 2、運行（三）膠條的平衡（四）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（五）膠上蛋白的檢測 1、考馬斯亮藍染色 2、銀染 3、負染 4、熒光染色第42頁/共67頁44（六）雙向電泳凝膠的檢測 1、目測 2、自動化檢測 3、雙向電泳的數(shù)據(jù)庫（七）雙向凝膠電泳技術當前面臨的挑戰(zhàn)： 1、低拷貝蛋白的檢測受限； 2、極酸或極堿蛋白的分離較難； 3、分子質量極大或極小蛋白的分離較難； 4、難溶蛋白的檢測較困難； 5、得到高質量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術第43頁/共67頁45第

12、44頁/共67頁46第45頁/共67頁47第46頁/共67頁48IPG膠條的蛋白質大約載樣量膠條的蛋白質大約載樣量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g /125 l200500ug/125 l11cm50200 g /185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 l第47頁/共67頁49第48頁/共67頁50預分步預分步收集收集細胞漿細胞漿細胞核細胞核 細胞膜細胞膜核糖體及其核糖體及其他特定細胞他特定細胞成

13、份成份細胞分細胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范圍陣列分離范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋低豐度或交叉覆蓋蛋白白陣列那些亞細胞定位陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質位置的功能蛋白質3倍3倍亞蛋白質組陣列策略的框架圖亞蛋白質組陣列策略的框架圖第49頁/共67頁51第50頁/共67頁52IEF的基本條件的基本條件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt

14、-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min 2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinear LinearLinear LinearRapidRapid第51頁/共67頁53第52頁/共67頁54第53頁/共67頁55

15、第54頁/共67頁56第55頁/共67頁57第56頁/共67頁58第57頁/共67頁59第58頁/共67頁60第59頁/共67頁61第60頁/共67頁62第61頁/共67頁63第62頁/共67頁64第63頁/共67頁65質譜技術進行蛋白質鑒定的基本流程質譜技術進行蛋白質鑒定的基本流程 樣品制備樣品制備 與與IPG膠條水膠條水化化 IPG電泳電泳 與上樣緩沖液浸潤與上樣緩沖液浸潤 SDS-PAGE 轉轉PVDF膜膜 膠內直接染色膠內直接染色 染色染色 取出蛋白點取出蛋白點 胰酶等消化胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上濃縮于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指紋肽指紋圖圖 數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)庫查詢 蛋白質鑒定蛋白質鑒定 已知已知 反向反向HPLC分離分離 MALDI-MS，PSD片段分片段分析析示知示知 ESI-MS-MS、微測序、微測序 第64頁/共67頁66實驗方法實驗方法完整蛋白質（如凝膠分離或完整蛋白質（如凝膠分離或色譜純化蛋白質）色譜純化蛋白質）肽混合物肽混合物質譜測定肽質量質譜測定肽質量（MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計算方法計算方法蛋白質序列數(shù)據(jù)庫（核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫蛋白質序列數(shù)據(jù)庫