藥物合成技術(shù)實驗報告

1、實驗報告班級：制藥092 學科：藥物合成技術(shù) 實驗名稱： 青霉素發(fā)酵實驗目的：1、了解（半合成）青霉素合成的生產(chǎn)工藝原理及過程 2、了解微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)藥物的常用技術(shù) 3、掌握微生物發(fā)酵在半合成青霉素生產(chǎn)中的應用 4、掌握利用離子交換樹脂分離藥物的方法實驗儀器：發(fā)酵罐、進料泵、空氣系統(tǒng)、計量泵一（加氨水）、計量泵二（加前體）、計量泵三（加消沫劑）、加菌種按鈕、預處理罐、轉(zhuǎn)筒真空過濾 器、混合罐、分離機、脫色罐、活性炭進料按鈕、結(jié)晶罐、真空抽濾機、洗滌罐、移出晶體按鈕、真空干燥機、輸入時間系統(tǒng)實驗內(nèi)容：一、實驗原理及相關(guān)知識1、青霉素的分子結(jié)構(gòu)：青霉素是6氨基青霉烷酸（6-aminopenic

2、illanicacid,-apa）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈 基團不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素g。工業(yè)上應用的有鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽。青霉素發(fā)酵液中含有5種以上天然青霉素（如青霉素f、g、x、k、f和v等），它們的差別僅在于側(cè)鏈r基團的結(jié)構(gòu)不同，其中青霉素g在醫(yī)療中用得最多，它的鈉或鉀鹽為治療革蘭氏陽性菌的首選藥物，對革蘭氏陰性菌也有強大的抑制作用。2、青霉素的作用機理：青霉素的抗菌作用與抑制細胞壁的合成有關(guān)。細菌的細胞壁是一層堅韌的厚膜，用以抵抗外界的壓力，維持細胞的形狀。細菌的細胞壁主要由多糖組成，也含有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。革蘭氏陽性菌細胞壁的組成是肽聚糖占細胞壁干重的5080（革蘭

3、氏陰性菌為110）、磷壁酸質(zhì)、脂蛋白、多糖和蛋白質(zhì)。其中肽聚糖是一種含有乙?；咸烟前泛投屉膯卧木W(wǎng)狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關(guān)鍵的酶即轉(zhuǎn)肽酶。青霉素作用的部位就是這個轉(zhuǎn)肽酶?，F(xiàn)已證明青霉素內(nèi)酞胺環(huán)上的高反應性肽鍵受到轉(zhuǎn)肽酶活性部位上絲氨酸殘基的羥基的親核進攻形成了共價鍵，生成青霉噻唑?；?酶復合物，從而不可逆的抑制了該酶的催化活性。通過抑制轉(zhuǎn)肽酶，青霉素使細胞壁的合成受到抑制，細菌的抗?jié)B透壓能力降低，引起菌體變形，破裂而死亡。 3、 發(fā)酵：這一過程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。接種量一般為520%。發(fā)酵周期一般為

4、45天，但也有少于24小時，或長達二周以上的。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時間取樣進行生化分析和無菌試驗，觀察代謝變化、抗生素產(chǎn)生情況和有無雜菌污染。4、發(fā)酵培養(yǎng)基的介紹：培養(yǎng)基是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五部分組成。5、提取：青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機溶媒中，調(diào)節(jié)ph

5、，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時，ph選擇2.8-3.0，從乙酸丁酯反萃到水相時，ph選擇6.8-7.2。為了避免ph波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進行反萃。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)ph2.83.0，加入醋酸丁酯。在一次丁酯萃取時，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加0.05-0.1%乳化劑ppb。二 、實驗步驟：（操作規(guī)程） a發(fā)酵工藝過程(1)、正常發(fā)酵過程： 1、 進料(基質(zhì))，開備料泵 2、 開備料閥 3、 備料后（罐重100

6、000kg）關(guān)備料閥 4、 關(guān)備料泵 5、 開攪拌器 6、 設置攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn) 7、 開通風閥 8、 開排氣閥 9、 投加菌種 10、補糖，開補糖閥 11、補氮，開加硫銨閥 12、開冷卻水，維持溫度在25 13、ph值保持在一定范圍內(nèi) 14、前體超過1kg/m3（扣分步驟，出現(xiàn)則扣分） (2)、出料1、 停止進空氣 2、 停攪拌 3、 關(guān)閉所有進料，開閥出料 (3)、發(fā)酵過程中ph值低調(diào)節(jié)ph值開大氨水流量 (4)、發(fā)酵過程中ph值高關(guān)閉進氨水 開大補糖閥 調(diào)節(jié)ph值 （5）、發(fā)酵過程中溶解氧低開大進空氣閥v02 調(diào)節(jié)溶解氧大于30%(6)、殘?zhí)菨舛鹊烷_加糖閥補糖 (7)、發(fā)酵過程中溫度高

7、開通冷卻水進水冷卻 溫度指標 (8)、泡沫高 添加消泡劑 泡沫高度降低到30cm b 提煉工藝過程(1)、預處理操作 1、打開閥v14，加發(fā)酵液。2、待加料至5000kg時，關(guān)閉閥v14。3、打開預處理罐攪拌器4、打開閥v13，加黃血鹽，去除鐵離子。5、觀察鐵離子濃度變化，待鐵離子濃度為零時，關(guān)閉閥v13。6、打開閥v12，加磷酸鹽，去除鎂離子。7、觀察鎂離子濃度變化，鎂離子濃度為零時，關(guān)閉閥v12。8、打開閥v11，加絮凝劑，去除蛋白質(zhì)。9、觀察蛋白質(zhì)濃度變化，蛋白質(zhì)濃度為零時，關(guān)閉閥v11。10、打開閥v16、v17及泵p5，同時打開轉(zhuǎn)筒過濾器開關(guān)及后閥v18。11、待發(fā)酵液經(jīng)過濾排至混合

8、罐b101后，關(guān)閉閥v16、v17、泵p5以及轉(zhuǎn)筒過濾器開關(guān)及后閥v18。12、 停止預處理罐攪拌器。(2)、一次ba萃取操作1、打開混合罐b101攪拌器2、打開閥v19，加ba（醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的1/41/3倍。3、關(guān)閉閥v19。4、打開閥v22，加稀硫酸調(diào)節(jié)ph值。5、待ph值調(diào)節(jié)至23時，關(guān)閉閥v22。6、打開閥v21，加破乳劑。7、加破乳劑量為100kg時，關(guān)閉閥v21。8、打開閥v23、v24及泵p6，向分離機注液。9、待分離機中有液位時，迅速打開a101開關(guān)。10、打開萃余相回收閥v26，調(diào)節(jié)v26閥門開度，控制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充分的溢流至b102。1

9、1、 待混合罐b101液體排空后，關(guān)閉閥v23、v24及泵p6。12、 停止混合罐b101攪拌器。13、 待分離機a101中液體排盡后，關(guān)閉閥v26。14、 關(guān)閉分離機a101開關(guān)（3）、一次反萃取操作1、打開混合罐b102攪拌器。1、 打開v28，加碳酸氫鈉溶液，質(zhì)量為青霉素溶液的34倍，并調(diào)節(jié)ph值為782、 待ph值調(diào)節(jié)至78時，關(guān)閉閥v28。3、 打開閥v29、v30及泵p7，向分離機a102注液。4、 待分離機a102中有液位時，迅速打開a102開關(guān)。5、 打開萃余相回收閥v32，調(diào)節(jié)v32閥門開度，控制重相液位在總液位的80%左右，輕相液能充分的溢流出。6、 待混合罐b102液體排

10、空后，關(guān)閉閥v29、v30及泵p7。7、 停止混合罐b102攪拌器。8、 待分離機中剩余少許重液時，關(guān)閉閥v32，防止輕液流入混合罐b103中9、 關(guān)閉分離機a102開關(guān)(4)、二次ba萃取操作1、打開混合罐b103攪拌器。2、打開閥v33，加ba（醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的1/41/3倍。3、關(guān)閉閥v33。4、打開閥v35，加稀硫酸調(diào)節(jié)ph值。5、待ph值調(diào)節(jié)至23時，關(guān)閉閥v35。6、打開閥v36、v37及泵p8。7、待分離機中有液位時，迅速打開a103開關(guān)。8、 打開萃余相回收閥v39，調(diào)節(jié)v39閥門開度，控制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充分的溢流至脫色罐中。10、 待混合罐b

11、103液體排空后，關(guān)閉閥v36、v37及泵p8。11、 停止混合罐b103攪拌器。12、 待分離機a103中液體排盡后，關(guān)閉閥v39。13、 關(guān)閉分離機a103開關(guān)。(5)、脫色罐操作1、 打開活性炭進料閥。2、 選擇進料量，進料25kg3、 進料4、 關(guān)閉進料閥。5、 打開脫色罐攪拌器，并設定攪拌時間：10min6、 攪拌10min后，打開閥v41、v42及泵p9，將青霉素溶液經(jīng)過過濾器排至結(jié)晶罐。7、 待脫色罐液體排空后，關(guān)閉閥v41、v42及泵p9。8、 停止脫色罐攪拌器。（6）、結(jié)晶罐及抽濾、干燥操作1、 啟動結(jié)晶罐攪拌器2、 打開閥v43，向結(jié)晶罐中加入醋酸鈉-乙醇溶液。3、 觀察青

12、霉素濃度，待青霉素剛好反應完時，關(guān)閉閥v43。4、 打開冷卻水閥v44及vd10，控制結(jié)晶罐溫度為5以下，并輸入保持時間，保持10min。5、 打開閥v45、v46及泵p10，將結(jié)晶液排至真空抽濾機進行抽濾6、 待真空抽濾機中上層液位達到50%左右后，迅速打開真空閥v47，進行抽濾。7、 同時打開v48，回收母液。8、 待結(jié)晶罐中液體排空后，關(guān)閉閥v45、v46及泵p10。9、 停止結(jié)晶罐攪拌器10、 抽濾完成后，關(guān)閉真空閥v47。11、 待母液全部回收后，關(guān)閉閥v48。12、 點擊“移出晶體”按鈕，將抽濾后的晶體移入洗滌罐。13、 打開閥v49，加丁醇進行洗滌。14、 待丁醇加入量為500k

13、g時，關(guān)閉閥v49。15、 啟動洗滌罐攪拌器，并設定時間為8min。16、 停止洗滌罐攪拌器。并設定時間，保持10min。17、 打開閥v50，排出廢洗液。18、 待廢洗液排盡后，關(guān)閉閥v50。19、 點擊“移出晶體”，將洗滌后的晶體移至真空干燥機。20、 啟動干燥機，進行干燥，并設定時間為20min21、 關(guān)閉干燥機開關(guān)，停止干燥。三、實驗操作圖發(fā)酵工藝操作界面發(fā)酵罐操作界四、實驗過程 1發(fā)酵工藝過程：菌種的保藏孢子的制備種子制備發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)滅菌發(fā)酵 2提煉工藝過程：發(fā)酵液預處理 提取 精制 脫色和去熱原質(zhì) 結(jié)晶 成品鑒定 成品分裝 五、注意事項 1、防止染菌：染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制

14、服染菌就不能實現(xiàn)質(zhì)高產(chǎn)。影響染菌的因素很多，而且?guī)щS機性質(zhì)，但只要認真對待，過細地工作，染菌是可以防止的。請到左邊的導航欄里選擇查看防止染菌的要點的內(nèi)容。 2、空氣系統(tǒng)的要求：防止空氣帶菌主要是提高空壓機進口空氣的潔凈度防止空氣夾帶油和水及空氣過濾器失效。提高空壓機進口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強空氣的壓縮前過濾著手。防止空氣夾帶油、水，除加強去除油、水的措施外，還必須防止空氣冷卻器漏水，注意勿使冷卻水壓力大于空氣壓力，防止冷卻水進入空氣系統(tǒng)。 3蒸汽系統(tǒng)的要求 ：重視飽和蒸汽的質(zhì)量，要嚴防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動，保證生產(chǎn)時所用的蒸汽壓力在3035千帕以上。

15、 (1)、連續(xù)滅菌設備：連消塔結(jié)構(gòu)要求簡單，易于拆裝和清理，操作時汽能與物料混合均勻，并易于控制溫度。 (2)、發(fā)酵罐：發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡與物料、空氣、下水道連接的閥門都必須保證嚴密度。 (3)、無菌室：用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。六：主要工藝指標編號指標推薦值發(fā)酵罐1糖濃度5kg/m32氨氮含量0.250.3kg/m33ph值68-724溫度255攪拌轉(zhuǎn)速150-250rpm6溶氧濃度30%7前體濃度1kg/m38發(fā)酵液中硫氨濃度0.25kg/m39發(fā)酵罐壓力0.07mpa一次ba萃取1醋酸丁酯（ba）用量青霉素溶液的1/32ph值2.8-3.03破乳劑用量100kg4、重相液位80%一次反萃取1碳酸氫鈉用量青霉素溶液的2.52ph值6.8-7.23重相液位80%二次ba萃取1醋酸丁酯（ba）用量青霉素溶液的1/32ph值2.8-3.03重相液位80%脫色罐1活性炭用量25kg結(jié)晶罐1結(jié)晶溫度52丁醇用量500kg3青霉素鈉鹽晶體效價1670u/ml七、青霉素的應用及總結(jié)