毛細(xì)管電泳測(cè)定阿片肽方法的探索

1、毛細(xì)管電泳測(cè)定阿片肽方法的探索 項(xiàng)目完成人員：董標(biāo) 董方霆 梁月琴 吳勝明 楊征 * 項(xiàng)目完成單位：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心 *中國(guó)人民解放軍第 307 醫(yī)院 摘 要 阿片肽是一類具有廣泛作用的神經(jīng)肽， 放射免疫分析 （RIA ）是目前測(cè)定生物體內(nèi)微量阿片肽 的一種靈敏方法，但也存在諸多缺點(diǎn)。為了開辟阿片肽定量的新途徑，我們以阿片肽的標(biāo)準(zhǔn)品（腦啡 肽、強(qiáng)啡肽、 -內(nèi)啡肽）為分離目標(biāo)， 采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)此進(jìn)行摸索。 以熒光素異硫氰酸鹽 （FITC ） 為衍生化試劑，建立用毛細(xì)管區(qū)帶電泳 -激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)測(cè)定亮氨酸腦啡肽（ Leu-ENK ）的方法， 檢測(cè)限達(dá) 10-14mol ，

2、線性范圍是 35.2563.1 fmol/ L，（ n=7） r=0.9985 。測(cè)得樣品微透析液中腦啡肽的 含量為 7.4 10-15 mol/ L ，并對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定阿片肽的方法進(jìn)行嘗試。阿片肽存在于哺乳動(dòng)物的組織和體液中， 作用極為廣泛， 具有鎮(zhèn)痛、 抑制呼吸和參與 應(yīng)激反應(yīng)等功能，與學(xué)習(xí)和記憶、生殖內(nèi)分泌、免疫功能的調(diào)節(jié)也密切相關(guān) 1 。阿片肽 的定量測(cè)定最常用的方法是放射免疫分析（ Radioimmunoassay，RIA ），它是通過專一活 性（specific activity）高的示蹤物，觀察抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物來定量微量物質(zhì)的一種 分析方法。其缺點(diǎn)是一個(gè)抗體和其它肽的交叉免

3、疫反應(yīng)，限制了分子的專一性；其次放 免試劑盒的成本較高，一種放免試劑盒只能測(cè)定其中一種阿片肽，操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，使用 時(shí)接觸有生物毒性的放射性物質(zhì)（如125 I），易對(duì)人體造成損害。毛細(xì)管電泳是上世紀(jì) 80 年代初迅速發(fā)展起來的一門分離分析技術(shù)，具有高效、快速、靈敏、樣品用量少等特點(diǎn)， 在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)、臨床等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用 2-3。毛細(xì)管電泳的分離 模式眾多，分離機(jī)理也各不相同，對(duì)樣品來源受到限制的少量體積樣品（如微透析液） 分析，尤其是毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)（CE-LIF），已成為首選技術(shù)。目前，CE-LIF 用于直接測(cè)定微透析液中物質(zhì)主要集中在一些氨基酸和生物胺等小分

4、子物質(zhì)方面 4-5，未 見測(cè)定多肽、蛋白等生物大分子的報(bào)道。為了開辟阿片肽定量的新途徑，對(duì)生物樣品中 微量的阿片肽能同時(shí)測(cè)定，我們以阿片肽的標(biāo)準(zhǔn)品（腦啡肽、強(qiáng)啡肽、-內(nèi)啡肽）為分離目標(biāo)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)此進(jìn)行摸索。一、實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器與試劑P/ACE5000 型毛細(xì)管電泳儀（ Beckman 公司，美國(guó)），配有紫外 -可見檢測(cè)器和氬離 子激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（ex = 488nm, em = 513nm）, Gold System數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；彈性 石英毛細(xì)管柱， 50、75 m 內(nèi)徑，購(gòu)自河北永年光導(dǎo)纖維廠。質(zhì)譜儀為電噴霧四極桿飛行 時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜Q-TOF 2,英國(guó)micromass公

5、司；亮氨酸腦啡肽（Leu-ENK）純度99%、 含量79%，強(qiáng)啡肽A（DYN A ）純度99%、含量72%，-內(nèi)啡肽（-EP）純度99%、含 量77%,均購(gòu)自sigma公司；熒光素異硫氰酸鹽（FITC）異構(gòu)體I、三羥基甲基氨基甲 烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）為進(jìn)口分裝；四硼酸鈉、硼砂、氫氧化鈉等試劑均 為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為 Milli-Q 級(jí),實(shí)驗(yàn)室自制。微透析液用微透析探針采自大鼠 腦部的伏隔核區(qū)，分子量截留大于 3500D,由合作單位提供。1.2 緩沖液的配制Tris-H3PO4緩沖液：稱取一定量的Tris,水溶解后，用H3PO4調(diào)pH,定容至所需濃。Tris-硼砂緩沖液

6、：稱取Tris和硼砂，適量水溶解后，用NaOH調(diào)pH，定容至所需濃 度。硼砂-硼酸緩沖液（含SDS）:稱取適量硼砂、硼酸、SDS,加一定量的水溶解后，用 NaOH調(diào)pH，定容至刻度。1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取一定量的阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解，配成濃度為 1mg/mL的儲(chǔ)備液， 放-20C保存，臨用前稀釋到所需的濃度。微透析液每次取 5 L,未作任何處理，直接進(jìn) 行衍生化分析。1.4 樣品的衍生化過程所有衍生化過程都在200 L具塞離心管中進(jìn)行。取一定量的樣品液和0.2mol/L pH9.0 碳酸鈉鹽緩沖液，衍生化時(shí)加入一定量的FITC溶液（0.2mg/mL,乙腈溶解，含1%甲醇、 0

7、.25%。吡啶v/v）,渦旋混勻后避光室溫反應(yīng) 12-14h?？瞻讓?duì)照按相同方法配制，每次樣 品衍生化時(shí)均同時(shí)制備空白對(duì)照。1.5 電泳條件柱子使用前用0.1mol/L的NaOH, H2O、運(yùn)行緩沖液分別洗柱10min,每次進(jìn)樣前用 H2O壓力沖洗2min,緩沖液沖洗4min。每分析4-5次后更換新的運(yùn)行緩沖液，UV或LIF 檢測(cè)。二、結(jié)果與討論2.1分離模式的選擇P/ACE5000型毛細(xì)管電泳儀配有檢測(cè)器（波長(zhǎng) 200nm、214nm、254nm、280nm）和 激光誘導(dǎo)熒光（LIF）檢測(cè)器（ex/ em 488/520nm）。由于UV檢測(cè)器的通用性，對(duì)于蛋 白質(zhì)、肽類樣品不需要任何處理即可

8、檢測(cè)，我們首先用UV檢測(cè)方法對(duì)阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離。采用MEKC的分離模式對(duì)阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣分離，僅Leu-ENK腦啡肽出現(xiàn)色譜峰。采用CZE分離，Leu-ENK、-EP、DYN A在不同的保留時(shí)間出峰，混合后進(jìn) 樣，三者能完全分開，見圖1、2。在相同進(jìn)樣量情況下，Leu-ENK色譜峰的吸收強(qiáng)度約 是MECC分離時(shí)的色譜峰強(qiáng)度的10多倍，故此確定CZE為分離模式。配制一系列不同 濃度的阿片肽標(biāo)準(zhǔn)混合液，進(jìn)行分離。阿片肽的UV最小檢測(cè)限約為2 10-12 mol/ L。文獻(xiàn)報(bào)道用RIA測(cè)定腦組織中內(nèi)源性阿片肽的濃度僅為 pg/mg的水平，UV檢測(cè)的靈敏度 遠(yuǎn)低于實(shí)際樣品的含量。LIF檢測(cè)是C

9、E所有檢測(cè)方法中靈敏度最高的一種方法。但是大多數(shù)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率很低，或不發(fā)熒光。特別是感興趣的一些生物大分子，如氨基 酸、多肽和多數(shù)蛋白質(zhì)等。因此，需借助衍生或熒光標(biāo)記技術(shù)，使待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)槟馨l(fā) 熒光的衍生物，提高檢測(cè)靈敏度。不同的熒光試劑有不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，標(biāo)記的對(duì) 象也不盡相同。常用的熒光衍生試劑見表 1 -。表1- 常用的熒光衍生試劑衍生試劑激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)反應(yīng)物、人曰7：古缶冊(cè)余十卜ex 490nm氨基酸、多肽、蛋熒光素異硫氰酸鹽(fluoresce in isothiocya nate, FITC )em 519 nm白質(zhì)熒光胺ex 390nm伯氨基酸(fluorecamine

10、)em 450nm鄰苯二甲醛ex 350nm氨基酸、多肽、蛋(o-phthaldialdehyde， OPA)em 450nm白質(zhì)、胺萘二醛衍生物ex 442nm氨基酸，多肽，生(naphthalene-2，3-dicarboxyaldehyde， NDA )em 490nm物胺3- （4-羧基甲?；?2-奎寧羧醛ex 456nm氨基酸、多肽3- (4-carboxybenzoyl) -2-quinoline，CBQCAem 552nm四甲基羅丹明異硫氰酸鹽ex 543nm em 570 nm(tetramethylrhodamine isothiocyanate，氨基酸、多肽TRITC )

11、異硫氰酸苯脂ex 290nm氨基酸、多肽、蛋(phenyl-isothiocyanate， PITC)em 345nm白質(zhì)9-芴基甲基氯甲酚酯ex 260nm氨基酸(9-fluorenylnethyl chloroformate ， FMOC )em 305nm恰當(dāng)?shù)剡x擇激發(fā)波長(zhǎng)和熒光標(biāo)記試劑，對(duì)提高檢測(cè)靈敏度有著重要意義。毛細(xì)管電 泳儀配備的LIF檢測(cè)器，其ex/ em為固定波長(zhǎng)（488/520 nm），限制了熒光試劑的選擇 范圍，最適合的熒光衍生試劑僅有 FITC。圖1 MEKC和CZE分離腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)品電泳圖MEKC的分離條件：毛細(xì)管柱：50 m 57cm ;電壓：20KV， 50mmol

12、/L pH8.5 硼砂，含 50 mmol/LSDS，檢測(cè):（UV ） 200nm 柱溫20 C，壓力進(jìn)樣 30s。腦啡肽0.5mg/mL CZE分離條件：毛細(xì)管柱：50 m 37cm ;電壓：15KV緩沖液：50 mmol/L pH2.5Tris-H 3PO4，檢測(cè)：（UV） 200nm 柱溫20 C，壓力進(jìn)樣4so腦啡肽0.5mg/mL圖2阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品混合物的CZE分離圖CZE分離條件：毛細(xì)管柱：50 m 37cm ;電壓: 15KV，緩沖液: 50 mmol/L pH2.5Tris-H 3PO4, 檢測(cè)：（UV） 200nm 柱溫20 C，壓力進(jìn)樣 2s。腦啡肽、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽均為0.5

13、mg/mL。2.2樣品衍生化條件的優(yōu)化FITC用于標(biāo)記胺、氨基酸、抗體等衍生化條件已有很多研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了達(dá)到最佳的檢測(cè)靈敏度和分離效率，對(duì)柱前衍生條件進(jìn)行優(yōu)化是6-8，用于多肽的衍生化必需的。影響衍生化的因素很多，有反應(yīng)時(shí)間、pH、緩沖液等，我們以Leu-ENK為對(duì)象對(duì)這些因素考察。文獻(xiàn)中溶解 FITC的溶劑有丙酮、乙腈、甲醇。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，用乙腈作 溶劑時(shí)，分離色譜圖上FITC副產(chǎn)物的峰少，F(xiàn)ITC-ENK色譜峰的熒光強(qiáng)度與丙酮、甲醇 作溶劑時(shí)相近，故選擇乙腈作為 FITC的溶劑。FITC衍生化的過程不快，隨著標(biāo)記化合物的不同，文獻(xiàn)上報(bào)道的反應(yīng)時(shí)間也不同。衍生化時(shí)微量吡啶的存在，會(huì)加

14、速反應(yīng)完成，且起到穩(wěn)定衍生化產(chǎn)物的作用5，因此配制FITC溶液時(shí)加入痕量的吡啶?？疾炝?2h、4h、 8h、12h、16h不同時(shí)間點(diǎn)的衍生化程度，發(fā)現(xiàn)在 12h反應(yīng)已完全，在實(shí)驗(yàn)時(shí)采取衍生化 反應(yīng)12-14ho比較碳酸鈉鹽（CB）緩沖液pH9.0和pH9.0的硼砂緩沖液對(duì)衍生化效率的 影響，二者結(jié)果相近。在優(yōu)化的衍生條件下對(duì)阿片肽的標(biāo)準(zhǔn)品Leu-ENK、-EP、DYN A分別進(jìn)行CZE-LIF度強(qiáng)對(duì)相光熒NYD-CCIDm4ln m圖3 CZE-LIF分離三種FITC衍生化的阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品電泳圖A空白對(duì)照，B腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)品，C內(nèi)啡肽標(biāo)準(zhǔn)品，D強(qiáng)啡肽標(biāo)準(zhǔn)品，1、2、3、4為FITC及其降解產(chǎn)物峰。分

15、離條件： 75 m 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂緩沖液，電壓 350kv/cm，LIF 檢測(cè)：ex/ em 488/520 nm，柱溫 25C， 壓力進(jìn)樣 3s。分析，結(jié)果如圖3。腦啡肽的FITC-ENK為一單峰，而-EP和DYN均為多個(gè)色譜峰， 可能是多重標(biāo)記造成的9，故強(qiáng)啡肽和-內(nèi)啡肽不適宜用FITC進(jìn)行衍生化測(cè)定，無法對(duì)-EP和DYN進(jìn)行定量分析。2.3分離條件的優(yōu)化進(jìn)樣方式的選擇：電動(dòng)進(jìn)樣與樣品溶液的離子強(qiáng)度和各組分的淌度有關(guān)，存在“電歧視” 現(xiàn)象，故均采用最常用的壓力進(jìn)樣方式。電泳分離效果的指標(biāo)主要考察FITC-ENK峰與FITC及其降解產(chǎn)物色譜峰的分離情

16、況。比較了不同毛細(xì)管長(zhǎng)度（47、57、67cm）和內(nèi)徑（50、75 m）的分離情況。毛細(xì)管柱長(zhǎng)分離度好，出峰時(shí)間延長(zhǎng)；在毛細(xì)管柱長(zhǎng)度相同 的情況下，50 m內(nèi)徑柱分離好于75 m，但由于進(jìn)樣量小，檢測(cè)限低于后者近一個(gè)數(shù)量 級(jí)。綜合各種因素，我們選擇的毛細(xì)管柱為75 m 67cm。考察Tris-硼砂緩沖液不同濃度（20、40、60、80 mmol/L）的分離效果，60 mmol/L分析效果最好。電泳緩沖液的濃 度太低，不僅樣品區(qū)帶會(huì)發(fā)生電擴(kuò)散，而且電滲流（EOF）的速度過快，降低FITC衍生 物的有效淌度差異，從而降低分離效率。隨著緩沖液的濃度增加，電滲流速度降低，溶 質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速率下降

17、，因此遷移時(shí)間延長(zhǎng)。但濃度太高，產(chǎn)生的焦耳熱的增加 也會(huì)降低分辨率和分離效率。緩沖液pH是又一影響電泳分離的重要因素，比較pH為8.6、 9.0、9.4、9.8、10.0緩沖液的分離結(jié)果，選擇 pH9.4的Tris-硼砂緩沖液。2.4工作曲線的建立取Leu-ENK儲(chǔ)備液，用水稀釋配制一系列不同濃度 （g/mL） 0.05、0.08、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00的Leu-ENK標(biāo)準(zhǔn)液，各取80 L,按1.4項(xiàng)下方法操作，加入 40 L的FITC和40 L碳酸鹽緩沖液，衍生化后進(jìn)行 CZE-LIF分析，所得結(jié)果見表2-2。以峰面 積A對(duì)其相應(yīng)的濃度 C（fmol/ L）進(jìn)行回歸

18、分析，結(jié)果見圖 4，得到回歸方程 A=0.49466+0.08592C n=7，r=0.9985。40aelA kdep CTI3020O度強(qiáng)對(duì)相光熒0u口圖10020030 0400KNb-minminJ *曲Concen tratioK Nl/4min表2-2腦啡肽的測(cè)定結(jié)果衍生化后腦啡肽的濃度（fmol/ L）測(cè)定的色譜峰面積35.23.2988956.35.5330470.46.20926140.814.15606281.523.09028422.336.54417563.149.49354圖5 CZE-LIF分離FITC衍生化的腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)品電泳圖A 空白對(duì)照，B ENK 標(biāo)準(zhǔn)品 35

19、.2 fmol/ L. ,C ENK 標(biāo)準(zhǔn)品 70.4 fmol/ L D ENK 標(biāo)準(zhǔn)品 140.8 fmol/ L， 分離條件：75 m 67cm ,60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂緩沖液，電壓 350kv/cm 丄IF 檢測(cè)：ex/ em 488/520 nm，柱溫25C， 壓力進(jìn)樣2s。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，得到ENK檢測(cè)限為1.6 10-15 mol/ L,電泳圖見圖5連續(xù)進(jìn)樣5次來考察所建立電泳方法的重復(fù)性，色譜峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為10.36%和0.72%。色譜峰面積的RSD較大，部分原因是衍生化后樣品中 含有易揮發(fā)的溶劑乙腈。一段時(shí)間后，

20、由于乙腈的揮發(fā)，樣品的體積變小，濃度相對(duì)變 大所致。文獻(xiàn)中報(bào)道CE-LIF的濃度檢測(cè)限達(dá)10-15mol/L水平，是在樣品濃度過高的情況下對(duì)FITC進(jìn)行衍生化，然后再逐級(jí)稀釋到所需濃度，不涉及實(shí)際微量樣品的分析測(cè)定。 這種條件下得到的檢測(cè)限實(shí)際上只反映了LIF檢測(cè)器的檢測(cè)靈敏度，并不能真實(shí)反映整個(gè)分析方法的檢測(cè)限。用建立的方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得微透析液中ENK的含量為7.4 10-15mol/ L，見圖 6。C實(shí)際樣品測(cè)定的 CZE-LIF圖圖6A空白對(duì)照 B腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)品 C微透析液分離條件：75 m 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂緩沖液，電壓 350kv/cm

21、，LIF 檢測(cè)：ex/ em 488/520 nm，柱溫 25C， 壓力進(jìn)樣 3s2.5串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定阿片肽我們還嘗試建立串聯(lián)質(zhì)譜Q-TOF測(cè)定阿片肽方法，根據(jù)質(zhì)譜峰強(qiáng)度來定量。配制一系列不同濃度的阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，檢出限為5 10-14 mol/ L。分析微透析液樣品,未檢出阿片肽，見圖7。另外，由于影響質(zhì)譜峰（離子流）的強(qiáng)度因素很多，用其定量較 為困難。圖7阿片肽標(biāo)準(zhǔn)品與微透析樣品的Q-TOF質(zhì)譜圖A :三種阿片肽混合物 lOOfmol/ L。 B微透析液樣品MS-MS測(cè)定條件：Cone電壓45 V。質(zhì)量掃描范圍 0.52ku。源溫 80C。去溶劑氣體溫 度150 C，去溶劑氣體流量

22、300L/h。碰撞氣體壓力 0.24 MPa。碰撞能量 3 050 Vo三、結(jié)論CE用于神經(jīng)肽方面的研究已有不少報(bào)道10-13,其中F?rt ts-Matei A.等11,13以阿片 肽標(biāo)準(zhǔn)品為分析對(duì)象，建立 CE的分離方法，用MEKC分離合成的強(qiáng)啡肽、腦啡肽及其 類似物，沒有應(yīng)用于實(shí)際樣品。用 CE直接測(cè)定微透析液中阿片肽的研究至今尚為見報(bào) 道，我們用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)阿片肽定量進(jìn)行摸索，建立CZE-LIF測(cè)定Leu-ENK的方法,并測(cè)定了微透析液中腦啡肽的含量。這對(duì)于研究腦啡肽的作用機(jī)制，具有一定的現(xiàn)實(shí)意 義。建立的CZE-LIF測(cè)定ENK的方法還需要在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)一步完善。參考文獻(xiàn)I. Olson G.A.，Olson R.D.，Kastin， A.J.， peptides 14 (1993) : 1339-13782林炳承 著，毛細(xì)管電泳導(dǎo)論，北京，科學(xué)出版社，1996: 180-2433鄧延倬，何金蘭 編著，高效毛細(xì)管電泳，北京，科學(xué)出版社，1996: 285-3334. Hernandez L.， Tucci