實(shí)驗(yàn)1微生物顯微鏡的使用細(xì)菌形態(tài)的觀察與細(xì)菌的革蘭氏染色

1、 顯微鏡油鏡的使用與保護(hù)顯微鏡油鏡的使用與保護(hù) 細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察 細(xì)菌的革蘭氏染色細(xì)菌的革蘭氏染色1 1）掌握顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)法）掌握顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)法2 2）認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)。）認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)。3 3）掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備、革蘭氏染色法）掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備、革蘭氏染色法 的步驟、細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果。的步驟、細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果。4 4）學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)）學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù) 1 1）顯微鏡油鏡的使用方法；）顯微鏡油鏡的使用方法；2 2）觀察細(xì)菌基本形態(tài)的染色裝片；）觀察細(xì)菌基本形態(tài)的染色裝片；3 3）觀察幾種常見(jiàn)細(xì)菌菌落；）觀察幾

2、種常見(jiàn)細(xì)菌菌落；4 4）進(jìn)行革蘭氏染色法的操作）進(jìn)行革蘭氏染色法的操作 顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，影響顯微鏡的分辨率。影響顯微鏡的分辨率。 顯微鏡物鏡中的油鏡放大倍數(shù)最大，可達(dá)顯微鏡物鏡中的油鏡放大倍數(shù)最大，可達(dá)100X,100X, 油鏡使用需在載玻片與鏡頭之間滴加鏡油（香油鏡使用需在載玻片與鏡頭之間滴加鏡油（香柏油）。柏油）。 油鏡的基本原理油鏡的基本原理總放大倍數(shù)總放大倍數(shù)( (物鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù)x x目鏡放大倍數(shù)目鏡放大倍數(shù)) )物鏡的數(shù)值孔徑物鏡的數(shù)值孔徑 N AN AN A=n sin n n是指介質(zhì)（空氣、浸油等）的折射率

3、；是指介質(zhì)（空氣、浸油等）的折射率； 是孔徑角的一半。是孔徑角的一半。分辨率分辨率顯微鏡所能分辨的兩點(diǎn)之間的距離顯微鏡所能分辨的兩點(diǎn)之間的距離分辨率分辨率 / 2N.A.= / 2 n sin （ 為所使用的光線的波長(zhǎng)）為所使用的光線的波長(zhǎng)） 增加照明亮度增加照明亮度 油鏡頭焦距很短，直徑很小，所需光照強(qiáng)油鏡頭焦距很短，直徑很小，所需光照強(qiáng)度最大度最大 增加顯微鏡的分辨率增加顯微鏡的分辨率 顯微鏡性能的優(yōu)劣主要決定其分辨率的大顯微鏡性能的優(yōu)劣主要決定其分辨率的大小。小。 當(dāng)物鏡與裝片間的介質(zhì)是空氣（空氣折射率當(dāng)物鏡與裝片間的介質(zhì)是空氣（空氣折射率n=1.0n=1.0）時(shí)，光線會(huì)發(fā)生折射，使進(jìn)入

4、物鏡的）時(shí)，光線會(huì)發(fā)生折射，使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度。光線減少，降低了視野的照明度。 當(dāng)介質(zhì)為香柏油時(shí)，香柏油的折射率（當(dāng)介質(zhì)為香柏油時(shí)，香柏油的折射率（1.521.52）與玻璃相近，光線可經(jīng)過(guò)載片直接進(jìn)入物鏡與玻璃相近，光線可經(jīng)過(guò)載片直接進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射，增加了照明度，更重要的是而不發(fā)生折射，增加了照明度，更重要的是增加了數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的。增加了數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的。 顯微鏡各部分名稱顯微鏡各部分名稱 透鏡的清潔透鏡的清潔 用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚（用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚（3:7/4:63:7/4:6）擦拭鏡）擦拭鏡頭。尤其是用完油鏡后。頭。尤其是用完油鏡后

5、。 干燥防止生霉干燥防止生霉鞏固顯微鏡油鏡的使用方法鞏固顯微鏡油鏡的使用方法認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察并描繪幾種常見(jiàn)微生物的基本形態(tài)與觀察并描繪幾種常見(jiàn)微生物的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu)顯微鏡、鏡油、鏡頭紙、擦鏡液顯微鏡、鏡油、鏡頭紙、擦鏡液細(xì)菌裝片：細(xì)菌三種基本形態(tài)裝片及細(xì)菌特殊細(xì)菌裝片：細(xì)菌三種基本形態(tài)裝片及細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)- -芽孢、鞭毛、莢膜裝片。芽孢、鞭毛、莢膜裝片。（1）觀察金黃色葡萄球菌、八疊球菌裝片。）觀察金黃色葡萄球菌、八疊球菌裝片。 注意菌體間的關(guān)系。注意菌體間的關(guān)系。（2）觀察枯草芽孢桿菌、大腸桿菌裝片。）觀察枯草芽孢桿菌、大腸桿菌裝片。

6、（3）觀察螺菌裝片。注意菌體的螺旋。）觀察螺菌裝片。注意菌體的螺旋。A. arrangement of cocci B. staphylococcus arrangement C. streptococcus arrangementD. sarcina arrangement E. diplococcus arrangementA. arrangements of bacilli B. single bacillus C. streptobacillusA. spiral forms B. spirillumC. spirochete (arrows) mixed with red blood

7、 cells D. vibrio（1）固氮菌（莢膜）裝片：注意菌體和莢膜的）固氮菌（莢膜）裝片：注意菌體和莢膜的染色差異，莢膜的大小、以及與菌體的關(guān)系。染色差異，莢膜的大小、以及與菌體的關(guān)系。（2）螺菌（鞭毛）裝片：注意鞭毛的染色、位）螺菌（鞭毛）裝片：注意鞭毛的染色、位置、數(shù)目、形狀和大小。置、數(shù)目、形狀和大小。（3）巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、破傷風(fēng)梭）巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、破傷風(fēng)梭菌裝片，注意孢體和菌體的染色差異，芽孢的菌裝片，注意孢體和菌體的染色差異，芽孢的形狀、大小和位置。形狀、大小和位置。細(xì)菌莢膜細(xì)菌莢膜掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備方法及革蘭氏掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備方法及革蘭氏染色

8、法的步驟染色法的步驟識(shí)別細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果識(shí)別細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù) (1)(1)顯微鏡、鏡油、擦鏡紙、擦鏡液顯微鏡、鏡油、擦鏡紙、擦鏡液(2)(2)結(jié)晶紫、革氏碘染液、結(jié)晶紫、革氏碘染液、95%95%酒精、番紅染液酒精、番紅染液(3)(3)載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、(4)(4)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 液體培養(yǎng)液、牙垢液體培養(yǎng)液、牙垢涂片涂片左手持菌液試管左手持菌液試管, ,右手持接種右手持接種環(huán)在火焰中灼燒環(huán)在火焰中灼燒, ,冷卻后從試?yán)鋮s后從試管中取菌液一滴管中取菌液

9、一滴, ,在潔凈載玻在潔凈載玻片上做一涂膜片上做一涂膜; ;從固體斜面或平板上取菌時(shí)從固體斜面或平板上取菌時(shí), ,用無(wú)菌接種環(huán)取少量菌體用無(wú)菌接種環(huán)取少量菌體, ,涂涂抹均勻于玻片上預(yù)先滴有的抹均勻于玻片上預(yù)先滴有的一滴自來(lái)水中一滴自來(lái)水中; ; 干燥干燥在空氣中自然干燥在空氣中自然干燥用鑷子夾住涂片一端用鑷子夾住涂片一端, ,在火焰上連續(xù)通過(guò)三次在火焰上連續(xù)通過(guò)三次; ;以載玻以載玻片在手背上試感覺(jué)不燙為宜片在手背上試感覺(jué)不燙為宜. .固定固定3.3.95%95%的乙醇脫色的乙醇脫色：滴：滴加加95%95%的乙醇，輕輕搖動(dòng)玻片的乙醇，輕輕搖動(dòng)玻片進(jìn)行進(jìn)行脫色脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，水洗

10、直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，水洗；1.1.結(jié)晶紫結(jié)晶紫初染初染 ：滴加數(shù)滴結(jié)晶紫染液滴加數(shù)滴結(jié)晶紫染液于細(xì)菌涂片上于細(xì)菌涂片上， 染色染色1 1分鐘，水洗分鐘，水洗；2.2.盧戈氏碘液盧戈氏碘液媒染媒染 ：用用盧戈氏盧戈氏碘液覆蓋涂片碘液覆蓋涂片1 1分鐘，水洗分鐘，水洗；4.4.蕃紅蕃紅復(fù)染復(fù)染： 滴加蕃紅染液復(fù)染滴加蕃紅染液復(fù)染2 2分鐘分鐘以上以上，水洗，水洗，吸干，吸干鏡檢鏡檢。載玻片上滴載玻片上滴加一滴香柏加一滴香柏油油，放放油鏡油鏡下鏡下鏡檢檢; ;注意注意標(biāo)本中細(xì)菌的形態(tài)標(biāo)本中細(xì)菌的形態(tài)、大大小小, ,排列排列, ,和顏色和顏色染色結(jié)果：染色結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陽(yáng)性菌呈呈紫色紫色

11、; ;革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌呈呈紅色紅色; ; 記錄革蘭氏染色結(jié)果記錄革蘭氏染色結(jié)果, ,并描述形狀并描述形狀, ,菌體排列和顏菌體排列和顏色色, , 看看與理論上是否相同看看與理論上是否相同; ;如不同如不同, ,分析原因分析原因; ; 分析影響革蘭氏染色結(jié)果的因素分析影響革蘭氏染色結(jié)果的因素; ; 牙垢里大概能看到幾類菌，哪幾種較多？牙垢里大概能看到幾類菌，哪幾種較多？ 載玻片是否干凈載玻片是否干凈, ,取菌量、合取菌量、合適的菌齡、適的菌齡、 熱固定及每一步熱固定及每一步水洗和酒精脫色程度是實(shí)驗(yàn)成水洗和酒精脫色程度是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵功的關(guān)鍵 禁止把染液倒入水池中禁止把染液倒入水池中, ,

12、回收回收到廢液桶中到廢液桶中菌齡：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，此時(shí)結(jié)果典型。菌齡：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，此時(shí)結(jié)果典型。操作：操作：熱固定：溫度不能太高，否則會(huì)造成細(xì)菌結(jié)構(gòu)的破壞。熱固定：溫度不能太高，否則會(huì)造成細(xì)菌結(jié)構(gòu)的破壞。染色：染料應(yīng)過(guò)量，避免結(jié)晶。染色：染料應(yīng)過(guò)量，避免結(jié)晶。 初染和媒染：時(shí)間在初染和媒染：時(shí)間在30-60s30-60s為宜。為宜。 復(fù)染：時(shí)間可稍長(zhǎng)復(fù)染：時(shí)間可稍長(zhǎng)脫色：約脫色：約30s30s，以流下的脫色液無(wú)色為準(zhǔn)，以流下的脫色液無(wú)色為準(zhǔn), ,否則制片上否則制片上會(huì)留有雜質(zhì)或造成假陽(yáng)性或假陰性。會(huì)留有雜質(zhì)或造成假陽(yáng)性或假陰性。水洗：要充分，否則制片上會(huì)留有雜質(zhì)。水洗：要充分，否則制片上會(huì)留有雜質(zhì)。 染液：石炭酸復(fù)紅，染液：石炭酸復(fù)紅，3鹽酸酒精，堿性鹽酸酒精，堿性美藍(lán)染液。美藍(lán)染液。 菌液：枯草芽孢桿菌菌液：枯草芽孢桿菌 器具：顯微鏡，載玻片，酒精燈，接種器具：顯微鏡，載玻片，酒精燈，接種環(huán)。環(huán)。（1 1）用接種環(huán)挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌菌液，涂）用接種環(huán)挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌菌液，涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后經(jīng)火焰固定。于玻片上做成薄膜，自然干燥后經(jīng)火焰固定。（2)2)滴加石炭酸復(fù)紅液于涂片上，用玻片夾住滴加石炭酸復(fù)紅液于涂片上，用玻片夾住涂片微火加熱，保持染液冒蒸汽約涂片微火加熱，保持染液冒蒸汽約5 5分鐘，分鐘， 切勿蒸發(fā)至干或使染液沸騰