水稻重組白蛋白的研發(fā)生產(chǎn)

1、 2009級(jí)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)專題講座課程論文報(bào)告 報(bào)告題目： 水稻重組白蛋白的研發(fā)生產(chǎn) 姓 名： 專業(yè)年級(jí)： 提交時(shí)間： 水稻重組人白蛋白的研發(fā)生產(chǎn)1 概述人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，是一種多功能用途廣泛的蛋白質(zhì)。由585個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，分子呈心型，理論分子量66438da，pI 4.7-4.9，沉降系數(shù)(S20，W)4.6，電泳遷移率5.92，585個(gè)氨基酸組成三個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，標(biāo)記為Domain，整個(gè)分子盤旋成球型。單鏈分子內(nèi)通過17.5對二硫鍵交叉連接，分子穩(wěn)定性較好。白蛋白純品為白色粉末，分子內(nèi)有較多極性氨基酸使其易溶于水，水溶液為黃褐色或暗綠色。

2、HSA是人血漿中最豐富的蛋白成分，占血漿總蛋白的60，每升成人血液中約有40g，白蛋白除存在于血漿中，也存在于組織、身體的分泌液、皮膚和淋巴腔中，構(gòu)成血管外池，滲透壓占全部血漿的80。HSA的mRNA由2078個(gè)核苷酸組成，HSA前體(prepro HSA)在肝臟中合成，并且在高爾基體中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，分泌進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。1, 2圖1 HSA的3D結(jié)構(gòu)Fig1. 3D structure of HSAHSA能維持血液動(dòng)力學(xué)平衡和血管內(nèi)滲透壓，吸收組織中多余液體到血液循環(huán)中，使動(dòng)脈壓升高，廣泛應(yīng)用于失血?jiǎng)?chuàng)傷燒傷引起的休克，腦水腫及損傷引起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹

3、水，低蛋白血癥的防治和新生兒高膽紅素血癥等。目前臨床使用的HSA制品絕大部分部是從人源血漿中提取純化而得（Plasma-derived HSA，pdHSA），來源有限，價(jià)格昂貴，還不能排除病毒（特別是艾滋病病毒和乙肝病毒）或其他潛在致病因子的影響，這都極大限制著HSA的廣泛應(yīng)用。到目前為止，由于血漿供應(yīng)緊張，HSA仍為緊俏藥品。所以說，研究低成本的方法來生產(chǎn)重組HAS（recombinant HAS，rHSA），可以作為pdHSA的安全替代物，并且可以使產(chǎn)量大大提高，滿足醫(yī)療應(yīng)用需求。3, 42 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀通過這些年的研究，多種不同的基因重組方法被研究出來用于生產(chǎn)rHSA，包括細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)

4、，酵母表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等等。2.1 rHSA在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)Lawn，RM等5在1981年首次報(bào)道了rHSA的cDNA序列和首次采用色氨酸(Trp)啟動(dòng)子，色氨酸引導(dǎo)肽及來自質(zhì)粒pBR322的Tcr和Ampr基因構(gòu)建了第一個(gè)表達(dá)重組人血清白蛋白的表達(dá)載體pHSAI，并在大腸桿菌(Ecoli)中得到了成功表達(dá)。但表達(dá)的rHSA含有585個(gè)氨基酸和人血清白蛋白前原蛋白(preproprotein)的24個(gè)氨基酸，并在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體聚集。Latta等6把HSA 的cDNA克隆到pXL276上也得到重組的metHSA，但當(dāng)把噬菌體c蛋白的前六個(gè)殘基(Val-Arg-Ala-Asn-Ly

5、s-Arg-)與成熟HSA基因融合后克隆到Ecoli中表達(dá)，通過胰蛋白酶(Trypsin)有效裂解得到同源成熟的HSA蛋白，與天然HSA蛋白并無二致。rHSA在枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)表達(dá)系統(tǒng)中得到分泌表達(dá)。一淀粉酶信號(hào)肽和中性蛋白酶信號(hào)肽序列都是有效的信號(hào)肽。但bHSA(bacteriaHuman serum albumin融合蛋白)的表達(dá)量與信號(hào)肽序列的有效酶解是成負(fù)相關(guān)的。72.2 rHSA在酵母表達(dá)系統(tǒng)由于rHSA分子量較大，在原核生物中表達(dá)產(chǎn)量不高(毫克級(jí))和分泌效果不夠理想，許多研究者開始用真核生物酵母，如釀酒酵母，畢赤酵母，克魯維酸酵母，粟酒裂殖酵母，多

6、形漢遜酵母等宿主菌來進(jìn)行重組白蛋白的表達(dá)。8酵母作為真核生物具有能對所表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，可將目的產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基的氧化環(huán)境有利于二硫鍵形成和天然構(gòu)象的蛋白分子表達(dá)。畢氏酵母作為宿主菌，還具有培養(yǎng)方法簡便，內(nèi)毒素含量低，表達(dá)水平高的特點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。但rHSA是由微生物分泌產(chǎn)生，其純化過程中需除去的雜質(zhì)種類較多。rHSA純化過程需除去的雜質(zhì)除某些剩余培養(yǎng)基成分（無機(jī)鹽）外，其余均源于宿主細(xì)胞，如宿主細(xì)胞分泌的雜蛋白、多肽、脂質(zhì)、多聚糖、熱原、色素等代謝產(chǎn)物以及細(xì)胞破碎釋放出的核酸及胞內(nèi)物等。導(dǎo)致提取產(chǎn)物的過程繁瑣，成本較高。2.3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)r

7、HSA研究表明，重組人血清白蛋白在大鼠，小鼠，山羊，奶牛等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中都能得到表達(dá)。在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，可通過微注射方法把HSA基因片斷注射到鼠受精卵中，這些基因通過同源重組的方式表達(dá)完整的HSA；也可以通過中間受體基因傳送把HAS的 DNA輸送到肝細(xì)胞中得到表達(dá)，且靶DNA基本上是以質(zhì)粒的形式存在于細(xì)胞中，拷貝數(shù)大于1000，且在4周內(nèi)可使表達(dá)量穩(wěn)定。HSA在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量與HSA基因含的內(nèi)含子有密切關(guān)系，且這些基因能夠很穩(wěn)定地遺傳給它們的下一代。由于HAS在動(dòng)物宿主表達(dá)時(shí)并不是把其cDNA轉(zhuǎn)到動(dòng)物宿主中，而是轉(zhuǎn)化其DNA，當(dāng)HSA的微基因含有內(nèi)含子1時(shí)表達(dá)量為25g/l，而當(dāng)含有內(nèi)含

8、子1和內(nèi)含子2時(shí)表達(dá)量達(dá)到35g/1；HSA內(nèi)含子是以嵌合方式來作用的，因此，高表達(dá)與微基因含的內(nèi)含子的特異個(gè)數(shù)比含整個(gè)HSA基因內(nèi)含子更有效。重組白蛋白基因通過細(xì)胞外植培養(yǎng)也可進(jìn)行分泌表達(dá)，rHSA表達(dá)時(shí)與乳蛋白基因一樣在外植培養(yǎng)時(shí)能夠很快地誘導(dǎo)，但在HSA轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控時(shí)受到胞外基質(zhì)的雙重調(diào)控。9, 102.4 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)rHSA研究證實(shí)，rHSA通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯和煙葉中得到成功的分泌表達(dá)。分泌表達(dá)時(shí)信號(hào)序列既可使用HSA的前原序列，也可采用馬鈴薯胞外蛋白PRS的信號(hào)序列來指導(dǎo)分泌。在轉(zhuǎn)基因的葉組織細(xì)胞和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)采用兩種信號(hào)肽都可進(jìn)行分泌表達(dá)，但經(jīng)過對rHSA的 N端分析發(fā)

9、現(xiàn)HSA前體的后加工處理為成熟的HSA與信號(hào)肽有關(guān)，HSA的preproHSA信號(hào)肽能引導(dǎo)proHSA的分泌和成熟HSA前體的部分加工；而馬鈴薯細(xì)胞的PRS信號(hào)肽與HSA融合后進(jìn)行表達(dá)時(shí)能夠在原序列處正確酶解加工，后處理的rHSA與天然的HSA完全一樣。11-132.5 轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)rHSArHSA表達(dá)研究至今，但目前仍處于新興產(chǎn)業(yè)階段。比較成熟的技術(shù)主要是利用酵母和細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)，因酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量高(克級(jí))且提純比較方便，所以利用酵母生產(chǎn)白蛋白有其優(yōu)越之處但也存在諸多不足之處。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌表達(dá)重組人血清白蛋白表達(dá)量高，翻譯后容易加工處理等具有誘人的前景，但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來源的r

10、HSA仍然存在病毒污染的危險(xiǎn)，技術(shù)也不成熟，目前主要處于實(shí)驗(yàn)階段。水稻用于重組白蛋白的生產(chǎn)，有著其他方式無可比擬的優(yōu)勢。水稻種子用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，因?yàn)槠淇梢詫?shí)現(xiàn)重組蛋白的高積累，得到的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性水平高，可長時(shí)間儲(chǔ)存，并在生產(chǎn)規(guī)模上可控制。此前的研究表明，人溶菌酶和口服乳鐵蛋白已水稻種子中成功表達(dá)。在這里，水稻種子作為規(guī)?；a(chǎn)的生物反應(yīng)器，生產(chǎn)水稻重組人血清白蛋白（Oryza sativa recombinant HAS，OsrHSA）。OsrHSA可以非常穩(wěn)定水稻種子中有效表達(dá)并可加工成本低廉，并且OsrHSA被發(fā)現(xiàn)和pdHSA生化特性，物理結(jié)構(gòu)，功能，和免疫原性都相同，可安全替代pd

11、HSA。143 研發(fā)思路和技術(shù)路線該實(shí)驗(yàn)的研發(fā)思路是通過基因重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)人體血清白蛋白在水稻種子中的重組生產(chǎn)。技術(shù)路線較為復(fù)雜，先將人白蛋白基因合成出來，構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌雙元載體，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，選取導(dǎo)入成功的農(nóng)桿菌與水稻的愈傷組織共同培養(yǎng)，然后對水稻進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平鑒定。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟和方法如下。3.1目的基因的獲得為了節(jié)省時(shí)間和資源，目的基因通過藍(lán)鷺生物技術(shù)公司(Blue Heron Biotechnology)合成得到，并分別在基因的5和3端加上SchI 和 XhoI酶切位點(diǎn)，并在目的基因的上游添加一段1,241-bp長的 Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列 (GenBank ac

12、cessionno. AP003256) ，該序列從水稻基因組TP 309中獲取的，這樣可以充分利用水稻基因的密碼子偏愛性來有效表達(dá)HSA基因。3.2 構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌雙元載體將合成的HSA基因用SchI 和XhoI雙酶切，并克隆進(jìn)pOsPMP01質(zhì)粒載體，得到了重組質(zhì)粒成為pOsPMP02。同時(shí)，為了構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌雙元載體，用HindIII 和 EcoRI雙酶切pOsPMP04載體，將得到的2,832-bp的片段克隆進(jìn)雙元載體pCambia1301，得到的重組載體命名為pOsPMP114，并將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105中。圖2 pOsPMP載體結(jié)構(gòu)Figure 2 pOsPMP carrier

13、 structure3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化將pOsPMP114 和 pOsPMP02通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化進(jìn)從水稻品種TP309分離得到的愈傷組織。3.4 轉(zhuǎn)化檢測用PCR方法鑒定出成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織，Gt13a信號(hào)肽的正向引物（5-gagggtgtggaggctcttgt-3）和HSA基因的反向引物（5- gtcacttcacgtctggaca-3）進(jìn)行PCR，用來確定轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。所用的PCR程序是如下：94變性5 min后，30個(gè)循環(huán)94 30s，58 30s，和72 45s。所有PCR陽性植株保持在溫室中培養(yǎng)直至成熟。3.5 粗提取和定量檢測在提取液（50 mM Tris (p

14、H 8.0), 100 mM NaCl）中研磨種子，12000g離心10min取上清，得到粗提取液。其中蛋白質(zhì)濃度可用BCA蛋白測定法測定。使用人血白蛋白ELISA定量試劑盒對HSA進(jìn)行量化，測定流程按試劑盒上的說明進(jìn)行，測定出水稻種子的蛋白產(chǎn)率。3.6 提取純化重組白蛋白將水稻種子研磨成粉，用磷酸鹽緩沖液（PB）（25 mM PB 50 mM NaCl ，pH 7.5）在室溫下溶解1小時(shí)，然后用乙酸調(diào)節(jié)pH為5，沉淀2小時(shí)，再12000g離心10min取上清。工業(yè)生產(chǎn)中，進(jìn)行大規(guī)模純化時(shí)，可采用壓力過濾器。上清裝在pH值為5時(shí)上滿Capto MMC柱子，用PB緩沖液（25 mM PB 100

15、 mM NaCl ，pH 7.0）洗脫。這步進(jìn)行的是陽離子交換層析，白蛋白吸附在層析介質(zhì)上，細(xì)胞碎片及部分雜質(zhì)不被吸附，直接流出。所收集的餾分，進(jìn)一步調(diào)節(jié)pH值為7.5，用Q Sepharose Fast Flow柱子純化，用pH7.5的PB緩沖液洗脫。這步進(jìn)行陰離子交換層析，去除抗原類物質(zhì)、碳水化合物和含色素的白蛋白。然后通過Phenyl HP柱子，使用0.45 M硫酸銨洗脫。這步進(jìn)行的是疏水親和層析，用于除去非抗原性的碳水化合物及部分色素。非抗原性的碳水化合物包括：戊糖、己糖、低聚糖、糖醛酸等。最后用Pellicon進(jìn)行超濾濃縮和超濾脫鹽，得到的是純度很好的rHSA蛋白溶液。3.7 重組白

16、蛋白純度分析(1)電泳分析：采用Phastsystem電泳系統(tǒng)，參照Phastsystem說明書，用8-25梯度膠進(jìn)行Native-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色，l0ug呈單帶。10-15%的梯度膠進(jìn)行SDS非還原和還原電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色，上樣量為2ug。(2)凝膠分析：HPLC分析使用TSK3000柱對終產(chǎn)品進(jìn)行分析檢測，流動(dòng)相為：0.3氯化鈉的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH6.5，流速1ml/min，進(jìn)樣量為100ul。3.8 無菌分裝經(jīng)過提取純化的rHSA經(jīng)純度檢定合格后，一般純度達(dá)到99.9%以上，即可進(jìn)行制劑，采用的劑型為水劑，將上述提純的rHSA進(jìn)行無菌過濾，小劑量

17、（10ml）包裝分裝，得到的就是利用水稻進(jìn)行基因重組生產(chǎn)的人白蛋白。在正常生產(chǎn)過程中，不包括前期的轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)，可在預(yù)留足夠的種子后大規(guī)模種植，得到的水稻進(jìn)行上述工藝加工，即大規(guī)模生產(chǎn)rHSA。4 rHSA與pHSA的比較利用生物技術(shù)重組微生物表達(dá)的rHSA與從人血漿中提取的pHSA是否完全一致，尤其是否具有相同的生理功能，是決定rHSA研究意義的重要指標(biāo)?，F(xiàn)已通過多種分析方法證明在分子組成和結(jié)構(gòu)上rHSA與pHSA完全相同。Wataru Ohtani等比較了兩者的理化特性及免疫化學(xué)特性。通過測定pH6.70.1情況下的rHSA的膠體滲透壓得到的第二維里系數(shù)與pHSA無明顯不同。在25%（

18、w/v）的藥用濃度下，rHSA與pHSA的粘度相同，均呈牛頓型流體特性。在脂肪酸含量方面，兩者所含脂肪酸種類相同，rHSA總脂肪酸含量高于pHSA，而rHSA 中棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）的含量高于pHSA。采用抗-pHSA 多克隆抗體法證明rHSA與pHSA的免疫化學(xué)特性相同。能與多種物質(zhì)結(jié)合是白蛋白的重要生理功能之一，這也是白蛋白活性的體現(xiàn)，Ohmura等分別以Bilirubin，Warfarin，lauric acid代表染料、藥物及脂肪酸來考察rHSA結(jié)合化合物的能力。實(shí)驗(yàn)表明，rHSA與這3種物質(zhì)的結(jié)合與pHSA一致。由此可見，rHSA 與pHSA 基本相同，兩者具有

19、相同的生理功能，rHSA可與pHSA同樣用于臨床。155討論植物源重組人血清白蛋白臨床前研究結(jié)果不僅與人血清白蛋白效果等同，而且產(chǎn)量比其他表達(dá)體系和同類技術(shù)體系分別高101000倍，成本只相當(dāng)于酵母或細(xì)菌發(fā)酵成本的2%10%，相當(dāng)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的0.01%0.05%，并且在1年內(nèi)就可以可獲得公斤級(jí)的重組蛋白產(chǎn)品，無動(dòng)物源、避免肝炎、艾滋病等病原的風(fēng)險(xiǎn)，水稻原料生產(chǎn)能耗僅為酵母的1/28，二氧化碳和污水排放為零。成功實(shí)現(xiàn)重組人血白蛋白規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化，完全擺脫了相關(guān)制約，具有純度更高、無動(dòng)物組分、安全、高效、綠色環(huán)保、廉價(jià)、無限量供應(yīng)等優(yōu)勢。隨著植物源重組人血清白蛋白的發(fā)展，我國人血清白蛋白日益緊

20、張的局面必將得到緩解，日后，待其產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大后，甚至可以滿足全世界的白蛋白需求。當(dāng)然，作為科研工作者，我們也可以借鑒轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)去生產(chǎn)其他的生物單分子產(chǎn)品，像免疫球蛋白等等。參考文獻(xiàn)1.Rosenoer, V.M., M. Oratz, and M.A. Rothschild, Albumin structure, function and uses. 1977.2.Geisow, M.J. and G.H. Beaven, Large fragments of human serum albumin. Biochem. J, 1977. 161: p. 619-625.3.Carter

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