熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則

1、5端的300-400bp區(qū)域1. 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。2. 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(自由能小于 58.61KJ/mol)。3引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間，上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%60%之間，45-55 %最佳。5堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。6引物自身不能有連續(xù) 4個(gè)堿基的互補(bǔ)。7引物之間不能有連續(xù) 4個(gè)堿基的互補(bǔ)。8引物5端可以修飾。9.3端不可修飾，而且要避開AT,GC rich的區(qū)域，避開 T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2-3個(gè))。10. 引物3端要避開密碼子的第 3位。11. 引物

2、整體設(shè)計(jì)自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于 9KJ/mol?？捎胦ligo 6軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。12. 做熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度 80-150bp最好，最長(zhǎng)是 300bp.13. 引物設(shè)計(jì)避免 DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。14. 引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70 %或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。15. 查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng) 度相似。16. TM值在58-62度之間。17. 引物設(shè)計(jì)的軟件 Primer 5.0有專門針對(duì)熒光的。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設(shè)計(jì)變

3、化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理： 引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為1830堿基?？偟恼f來，決定引物退火溫度( Tm值)最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有 以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。在引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí)：4(G+C)+2(A+T)-5 C在引物長(zhǎng)度大于 20bp 時(shí)：62.3 C +0.41 C (%G-C)-500/length-5 C另外有許多軟件也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理會(huì)各有不同，因此有時(shí)計(jì)算岀的數(shù)值可能會(huì)有少 量差距。為了優(yōu)化 PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于 54 C的最短的引物可獲得最好的效率和特異性?？偟恼f來，每增加一個(gè)核苷酸引

4、物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。 GC含量一般引物序列中G+C含量一般為40%60%，對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物 5端加適量的A、T或G、C尾巴。 退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低 5C,如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度， 是DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差 4 C 6C不會(huì)影響PCR

5、的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在55C75C間變化。 避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（AG）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用 7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 與靶DNA的錯(cuò)配當(dāng)被擴(kuò)增的靶DNA序列較大的時(shí)候，一個(gè)引物就有可能與靶 DNA的多個(gè)地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用BLAST軟件進(jìn)行檢測(cè)，網(wǎng)址：。選擇Align two sequence

6、s (bl2seq)，如下圖iftiiE) Jfijhi : iitty- ncbl- uliirt toir/BLliS? Th.SUtisliei ofSqunc SimiUr*y Scotti4f 衍Why cfwm With 廠勺j.山品 1 dprorrtij?- hwdatt4fiM0|nf | 0nuflnf ：|IGeneivn*1&Trt*dgjfii 怖 orer- dAiW ibbctil Mnw mniiitiitp anu w* , cnw, pgt Apgi c*Sg ftwart 0 ovffilonds Developtr iftfa j j4irid Lun

7、ic irtt BWlgnMMal wasOther(BSOUTCSipa3l Rtltrftnce I4CB1Cantriteiitari 啊L帕list Contact鬥r 0*10 fipKsun dM4 Gt員昕沿草論”jl&3 Ijr L?LI tlid rkLT! lAetiLfMJi jnojkr- r. T s諸】 丁 if r訂二生僉 &feiwat3BLAST的使用方法也十分簡(jiǎn)單，如下圖所示r Use Hue鼻 BLA$T Strand optionOpsn F and extension &wp E pen-altissap x_dropoff 所 street i0 v

8、ord size 何Filter P 機(jī)館“ I:jti.；o 1 Enter mi詐wig qh GI Ior dQwnlo&d frin file.，.； Ent期 accession ar G1|通or 弓廠 iji】nuo ir, FA .T. fornatFi k nb-riid iiom fili?Al Octtr Idput生命科學(xué)問題解決之逍bi s己q口弓nt百 in FA3TA forma-t fi : P- l將引物序列粘貼到1區(qū)，將靶DNA序列粘貼到2區(qū)，這兩者可以互換的，并且 BLAST會(huì)計(jì)算互補(bǔ)、反義鏈等多種可能，所以不需要用戶注意兩條鏈?zhǔn)欠穸际怯辛x鏈。如果知道序列

9、在數(shù)據(jù)庫中的 GI號(hào)也可以直接輸入GI號(hào)，這樣就不用粘貼一大段的序列了。最后在3處點(diǎn)擊Align就可以查看引物在靶 DNA中是否有多個(gè)同源位點(diǎn)了?？墒鞘褂肂LAST還是有其不方便的地方。因?yàn)樗淮沃荒鼙容^兩條序列，那么一對(duì)引物就需要分開進(jìn)行 比對(duì)。如果存在錯(cuò)配，還需要自己計(jì)算由于錯(cuò)配形成的片段長(zhǎng)度有多大。在下一篇中將介紹一個(gè)軟件，可 以直接將靶DNA和引物輸入對(duì)產(chǎn)物片段進(jìn)行預(yù)測(cè)。 引物末端引物3端是延伸開始的地方，因此要防止錯(cuò)配就從這里開始。3端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR (AS-PCR)反應(yīng)中，引物3

10、端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第 3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物 與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入

11、蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為 了下一步的操作就要作岀適當(dāng)?shù)臓奚?。很多時(shí)候PCR只是初步克隆，之后我們還需要將目的片段亞克隆到各種載體上，那么就需要在PCR這個(gè)步驟為下一步的操作設(shè)計(jì)額外的堿基。以下總結(jié)一些為了亞克隆所要設(shè)計(jì)的序列。a添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn)是將PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點(diǎn)是六個(gè)堿基，另外在酶切位點(diǎn)的 5端還需要加23個(gè)保護(hù)堿基。但是不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目是不相同的，例如：Sal I不需要保護(hù)堿基，EcoRV需要1個(gè)，No

12、t I需要2個(gè)，Hind山3個(gè)。其中，在原核表達(dá)設(shè)計(jì)引物時(shí)還有一些小技巧，大 家可以參考：原核表達(dá)之實(shí)驗(yàn)前的分析。里面一些規(guī)則是所有表達(dá)都通用的。有一種做法是在進(jìn)行 PCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)中的酶切反應(yīng)率，見附錄。不過這種方法雖然方便但并不推薦。有時(shí)候，就是把PCR產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進(jìn)行會(huì)使岀現(xiàn)問題的原因變得更加復(fù)雜。一旦岀現(xiàn)問題，分析起來更麻煩。b LIC添加尾巴LIC的全稱是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司專門為其部分的 pET載體而發(fā)明的一種克隆方法。用LIC法制備的pET載

13、體有不互補(bǔ)的12-5堿基單鏈粘端，與目的插入片段上相應(yīng)粘端互補(bǔ)。擴(kuò) 增目的插入片段的引物 5序列要與LIC載體互補(bǔ)。T4 DNA 聚合酶的3 -5外切活性經(jīng)短時(shí)間即可在插入 片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖俑咝?，而且為定向克隆。c定向TA克隆添加尾巴在T載體剛岀的時(shí)候大家都拍手稱贊，真是方便，哪個(gè)小子腦子這么聰明想岀來的。但是后來人們發(fā)現(xiàn)TA克隆無法將片段定向克隆到載體中，所以后來Invitrogen推出了可以定向克隆的載體，它的一端含有四個(gè)突出的堿基GTGG。因此在PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)也要相應(yīng)的加上與之互補(bǔ)的序列，這樣片段就可以有方向了。d In-Fusion克隆方法這項(xiàng)技術(shù)是Clontech還屬于BD的時(shí)候推出的。此技術(shù)就其步驟來說是及其方便的，不需連接酶，不需長(zhǎng) 時(shí)間的反應(yīng)。只要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候引入一段線性化載體兩端的序列，然后將PCR產(chǎn)物和線性化的載體加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室溫下放置半個(gè)小時(shí)就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化