胚胎試驗(yàn)在水生動(dòng)物中的應(yīng)用

1、胚胎試驗(yàn)在水生動(dòng)物中的應(yīng)用李康2004.11.12建立靈敏、簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法 急性暴露試驗(yàn)雖然簡(jiǎn)便易行，但是其檢測(cè)指標(biāo)過于簡(jiǎn)單。 各種慢性毒性試驗(yàn)雖然提供多個(gè)檢測(cè)終點(diǎn)，但存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高等不足。 而水生生物胚胎試驗(yàn)具有成本低、影響因素少、靈敏度高等方面的優(yōu)勢(shì)，受試物種也由最初的魚類向多樣化發(fā)展，其應(yīng)用日益廣泛。 魚類成體和胚胎試驗(yàn)靈敏度比較胚胎試驗(yàn) 胚胎試驗(yàn)是又稱胚胎毒性試驗(yàn)或胚胎致畸試驗(yàn)，指通過把胚胎暴露于受試化學(xué)物質(zhì)而受到毒害作用，繼而影響胚胎的發(fā)育、導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯或胚胎畸形。 廣義上的胚胎試驗(yàn)包括所有以胚胎為材料的生物學(xué)試驗(yàn)，其內(nèi)容涵蓋形態(tài)學(xué)、發(fā)育學(xué)、毒理學(xué)、行為學(xué)等方面 。

2、魚類 魚類因具有繁殖力高、體外產(chǎn)卵、體外受精等生殖特性成為胚胎試驗(yàn)的最主要材料。拉丁名 通用名 文獻(xiàn) oncorhynchus mykiss rainbow trout 1,2 danio rerio zebrafish 1 brachydanio rerio zebrafish 2 cyprinus caprio common carp 1,2 oryzias latipes medaka 1,2 pimephales promelas fathead minnow 1,2 carassius auratus goldfish 1 menidia peninsulae tidewater s

3、ilverside 1,2 lepomis macrochirus bluegill 1 clupea harengus herring 1 gadus morhua cod 1 cyprinodon variegates sheepshead minnow 1,2 oncorhynchus kisutch coho salmon 2 oncorhynchus tschawytscha chinook salmon 2 salmo trutta brown trout 2 salmo salar atlantic salmon 2 salvelinus fontinalis brook tro

4、ut 2 salvelinus namaycush lake trout 2 esox lucius northern pike 2 catostomus commersoni white sucker 2 lepomis macrochirus bluegill 2 ictalurus punctatus channel catfish 2 jordanella floridae flagfish 2 gasterosteus aculeatus three-spined stickleback 2 menidia menidia atlantic silverside 2 用于胚胎試驗(yàn)的一

5、些種類斑馬魚 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)單一物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)往往使用特定的種類，斑馬魚是其中一個(gè)重要代表。歐洲和美國(guó)都有已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。zebrafish (danio rerio)甲殼類 草蝦 草蝦屬廣鹽性甲殼動(dòng)物 (3-31ppt)。 分布廣(遍布美國(guó)東海岸和墨西哥灣的廣大河口)。 個(gè)體小，只要水溫，光照條件適宜，成體在實(shí)驗(yàn)室容易繁殖，只需分離不同發(fā)育階段的胚胎即可用于試驗(yàn)。 盡管雌體產(chǎn)卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎離體后同樣可以正常發(fā)育至孵化， 卵外被膜、胚胎透明而易于觀察形態(tài)異常。grass shrimp (palaemonetes pugio)grass shrimp (palaemonetes

6、pugio)其它動(dòng)物 the frog embryo teratogenesis assay-xenopus (fetax) 爪蟾 astm e 1563-98: standard guide for conducting static acute toscicity tests with echinoid embryos 海膽 medaka (oryzias latipes) blue crab (callinectes sapidus)試驗(yàn)動(dòng)物的選取 被廣泛利用 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)容易大量培養(yǎng) 具有代表性和對(duì)受試物的敏感性 遺傳背景清楚 試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)也有相應(yīng)的規(guī)范胚胎來源 多數(shù)魚類產(chǎn)卵后離體孵化

7、，易于收集 。 一般可采用親魚人工催產(chǎn)結(jié)合人工受精的方法獲得 。 對(duì)于如斑馬魚，青鳉等小型種類，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖相對(duì)容易，只需控制適當(dāng)?shù)奈锢項(xiàng)l件，一般都能在試驗(yàn)當(dāng)天取到足夠數(shù)量的受精卵 。野外試驗(yàn) 收集魚卵 在實(shí)驗(yàn)室完成剩余的發(fā)育過程，檢測(cè)多個(gè)終點(diǎn)指標(biāo) 。 原位暴露 在室內(nèi)得到受精卵，用適當(dāng)?shù)难b置放置于待檢測(cè)的地點(diǎn)，全部發(fā)育過程或絕大部分發(fā)育過程在野外完成。 有抱卵習(xí)性的甲殼動(dòng)物，胚胎在母體腹部附肢發(fā)育成幼體，通過捕撈帶卵的母體，分離胚胎。分類 胚胎試驗(yàn)同樣可分成急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn) 。 急性毒性試驗(yàn)時(shí)間較短，其目的是獲得有關(guān)受試物的初步毒性信息；亞急性毒性試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，可以貫穿胚胎發(fā)育

8、的整個(gè)時(shí)期。 暴露途徑 可分為靜態(tài)，半靜態(tài)和流動(dòng)等 ，或微注射的途徑。 容器 透明的試驗(yàn)容器通常是首選，燒杯、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管是最普通的工具。 在野外暴露試驗(yàn)中，有黏性的受精卵可以被直接負(fù)在載玻片上，后者固定在特制的容器里 。溶劑 有機(jī)物質(zhì)水溶性較差，則需要化學(xué)溶劑來助溶，但不適當(dāng)?shù)娜軇?huì)影響結(jié)果的可靠性，化學(xué)溶劑本身對(duì)胚胎具有毒性甚至?xí)褪茉囄锂a(chǎn)生協(xié)同作用，因此，選用適當(dāng)?shù)娜軇┮约斑m當(dāng)?shù)臐舛葘?duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性都是有益的。 乙醇，丙酮，二甲亞砜是常用的溶劑，終濃度一般在0.1%以下 。0.5%(v/v)乙醇1%(v/v)乙醇對(duì)照grass shrimp (palaemonetes pugio)檢測(cè)終

9、點(diǎn) 半致死濃度（lc50） 形態(tài)異常 孵化延遲 生化指標(biāo) 遺傳物質(zhì) 生長(zhǎng)指標(biāo)半致死濃度（lc50） 半致死濃度（lc50） 死亡是檢測(cè)的可見終點(diǎn)，初步反映受試物的毒性，是急性毒性試驗(yàn)的常用指標(biāo) 。 孵化也可作為終點(diǎn)來反映受試物毒性，指標(biāo)采用半效應(yīng)濃度（ec50）。 在發(fā)育早期可以胚胎完整性來判斷存活與否，當(dāng)器官出現(xiàn)后則用器官的運(yùn)動(dòng)作為標(biāo)準(zhǔn)。 形態(tài)異常 形態(tài)異常是胚胎致畸試驗(yàn)的核心內(nèi)容 。 斑馬魚和爪蟾胚胎發(fā)育過程中有多種可以觀察的反應(yīng)指標(biāo)，被列入標(biāo)準(zhǔn)方法的觀察終點(diǎn)。 對(duì)于甲殼動(dòng)物，常見的觀察結(jié)構(gòu)有眼、卵黃形狀、心臟、頭部、肝胰腺 。 發(fā)育異常往往會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致終止發(fā)育或發(fā)育延遲，進(jìn)而推遲孵化時(shí)間。

10、 b = brain; c = chorda; ch =chorion; e = ear; ed = edema; eud = ear underdeveloped; ey = eye; eyud= eye underdeveloped; nc = negative control; tnd = tail not detached;woey = without eyes; woh = without head; wos = without somitescatfish (clarias gariepinus) 對(duì)照 cd 和cu1%(v/v)乙醇對(duì)照grass shrimp (palaemon

11、etes pugio)孵化延遲grass shrimp (palaemonetes pugio)生化指標(biāo) 隨著胚胎發(fā)育的深入，器官逐漸建成，一些酶活性也顯示出來，在暴露條件下酶活性的改變也可作為檢測(cè)終點(diǎn)；受試物既可抑制酶活性，也可使一些酶出現(xiàn)應(yīng)激性增強(qiáng) 。grass shrimp (palaemonetes pugio)受試物及其代謝物還可能對(duì)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生影響 grass shrimp (palaemonetes pugio)生長(zhǎng)指標(biāo)catfish (clarias gariepinus)pacfic herring (clupea pallasi)應(yīng)用現(xiàn)狀 單一化學(xué)品毒性 環(huán)境檢測(cè)項(xiàng)目 檢測(cè)

12、土壤、沉積物污染 。 石油降解產(chǎn)物；溢油事件的生態(tài)恢復(fù)研究 。 混合性工業(yè)生產(chǎn)廢水，生活污水的毒性，特別是致畸效應(yīng)，被用于探討遺傳毒性。 名稱 拉丁名 污染物 文獻(xiàn) inland silverside pacific herring sturgeon mummichog rainbowfish surf smelt fathead minnows medaka grunion carp flagfish pacific herring medaka fathead minnows rainbow trout catfish medidia beryllina clupea harengus o

13、ryzias latipes clupea harengus oncorhynchus mykiss 石油及降解產(chǎn)物 殺蟲劑及除草劑 有機(jī)物 重金屬 7 8,80 9 10 11 13 30 59，60，68 62 35 38 28 44 48 67 23 分類 化合物 終點(diǎn) 參考文獻(xiàn) 抗真菌劑 石油 重金屬 殺蟲劑 有機(jī)化合物 chlorothalonil copper chromium aluminum methoprene endosulfan chlorpyrifos malathion fipronil anthracene pyrene -terthienyl methylene blue 2-methyl-1,4-naphthoquinone 4-nitroquinoline-n-oxide ethanol dimethylsulfoxide acetone 1 19 19，64 51 51 57 64 17,18 17,18 17,18 17,18 55 55 發(fā)展