泰樂發(fā)酵優(yōu)化

1、泰樂菌素發(fā)酵生產(chǎn)泰樂菌素發(fā)酵生產(chǎn)改良辦法改良辦法主要內(nèi)容主要內(nèi)容泰樂菌素介紹泰樂菌素介紹改良的基本途徑改良的基本途徑選育改良的具體目標(biāo)選育改良的具體目標(biāo)總述總述抗生素的發(fā)現(xiàn)抗生素的發(fā)現(xiàn)青霉素能抑制其周圍葡萄球菌的生長(zhǎng)；鏈霉菌對(duì)頑固的結(jié)核桿菌有明顯抑制作用 。拮抗作用：一類微生物抑制或殺死它類微生物的作用。1.抗生素介紹抗生素介紹一、一、泰樂菌素介紹泰樂菌素介紹 抗生素的概念：抗生素的概念：抗生素是指微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的，在低濃度下就能抑制它種微生物的生長(zhǎng)和活動(dòng)，甚至殺死它種微生物的化學(xué)物質(zhì)。 來(lái)源來(lái)源: 微生物，高等動(dòng)、植物產(chǎn)生的代謝物，化學(xué)方法合成或半合成的化合物。 性能：性能：抗細(xì)菌、

2、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、殺蟲除草等。2. 2. 泰樂菌素介紹泰樂菌素介紹 泰樂菌素泰樂菌素( Tylosin)：又名泰樂星，泰洛霉素，為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它對(duì)支原體抗性最強(qiáng)，低毒廣譜，可用于治療由耐青霉素細(xì)菌引起的感染，主要抗G +，對(duì)大部分G - 、螺旋體、大病毒也有作用。產(chǎn)生菌有弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae, NRR2702, 2703) ，龜裂鏈霉菌( S. rim osns )和吸水鏈霉菌( S.hygro - scop icus) 。工業(yè)生產(chǎn)多利用新霉素鏈霉菌。 合成：合成：泰樂菌素內(nèi)酯環(huán)是由五個(gè)丙酸、二個(gè)乙酸和一個(gè)丁酸組成,內(nèi)酯環(huán)上再依次連上6 -

3、 脫氧- D - 阿洛糖 (M yc inose),碳霉氨基糖(M ycam inose) 和紅霉糖(碳霉糖,M yca rose) 。以上三個(gè)糖均來(lái)自葡萄糖, N -上兩個(gè)甲基及2及3上的兩個(gè)甲基來(lái)自甲硫氨酸。 發(fā)酵發(fā)酵：發(fā)酵過(guò)程中，同時(shí)存有4個(gè)組份，分別是泰樂菌素A，去碳霉糖泰樂菌素B、大菌素C及雷洛菌素D。發(fā)酵初期生物合成以泰樂菌素A 為主，隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，A組份與C組份比例發(fā)生轉(zhuǎn)化，A 組份相對(duì)減少，C組份相應(yīng)升高。由于A 組份具有最強(qiáng)的生物活性，發(fā)酵后期, 需將C組份向A 組份定向轉(zhuǎn)化，使A 組份含量達(dá)80% 以上，方能放罐，組份A 與組份C 結(jié)構(gòu)之間的差別，主要是R2基的不同，

4、要使組份C轉(zhuǎn)化為組份A，必須促使組份C進(jìn)行甲基化反應(yīng)，必須有大菌素C甲基轉(zhuǎn)移酶的促進(jìn)作用。二、育種二、育種改良的具體目標(biāo)改良的具體目標(biāo) 提高產(chǎn)量。提高產(chǎn)量。(2) 提高產(chǎn)物的純度提高產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)減少副產(chǎn)物物；提高有效組分提高有效組分 。(3) 改變菌種性狀改變菌種性狀。(4) 使種的遺傳性狀使種的遺傳性狀，特別是生特別是生產(chǎn)性狀穩(wěn)定。產(chǎn)性狀穩(wěn)定。(5) 改變生物合成途徑改變生物合成途徑，以獲得以獲得新產(chǎn)品。新產(chǎn)品。三、改良的基本途徑三、改良的基本途徑 最常用的菌種改良手段是誘變及篩選。隨著對(duì)抗生素生物合成途徑及其相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究的深人， 抗生素育種技術(shù)結(jié)構(gòu)將會(huì)逐步轉(zhuǎn)向以基因工程

5、技術(shù)為主的多樣化的育種結(jié)構(gòu)方式。國(guó)內(nèi)外采用多種方式提高泰樂菌素生產(chǎn)產(chǎn)量，介紹如下：（1）傳統(tǒng)的誘變及篩選傳統(tǒng)的誘變及篩選（2）發(fā)酵過(guò)程改良發(fā)酵過(guò)程改良（3）基因重組基因重組（4）基因工程技術(shù)基因工程技術(shù) 傳統(tǒng)的誘變及篩選是最常用的菌種改良手段。菌種選育的第一步工作就是利用自發(fā)突變進(jìn)行自然選擇。所謂自然選擇就是從一個(gè)菌種的群體中,不經(jīng)過(guò)任何誘變因素處理, 利用自發(fā)突變直接選擇所需要的變種。目前許多新抗生素的生產(chǎn)菌種的選育也以自然選擇為開端。1.傳統(tǒng)的誘變及篩選傳統(tǒng)的誘變及篩選 新誘變因子及誘變技術(shù)的開發(fā)：新誘變因子及誘變技術(shù)的開發(fā)：新的誘變劑- 低能離子束（離子注入是20 世紀(jì)80 年代興起的一

6、種表面處理技術(shù)）。近年來(lái)，激光輻射誘變和微波電磁輻射誘變亦頗受注意。多年來(lái)為提高誘變效率,育種工作者在誘變方法上作了不少改進(jìn)。其中尤以原生質(zhì)體誘變的效果比較突出。誘變時(shí)增變因子(助變劑) 等的作用自然選擇的目的:純化原種穩(wěn)定生產(chǎn)鞏固變種和雜種的特性提高產(chǎn)量。 誘變是用物理、化學(xué)或生物的誘變因子修改目的微生物的基因組，產(chǎn)生突變型。在實(shí)踐中也還有用抗生素作為誘變劑的實(shí)例。誘變育種包括個(gè)環(huán)節(jié)以合適的誘變方法處理大量而分散的微生物細(xì)胞懸浮液, 在引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí), 使存活個(gè)體中的變異頻率大大提高設(shè)計(jì)一種有效的篩選方法淘汰負(fù)變株, 并把正變株中少數(shù)變異幅度最大的具有優(yōu)良性狀的菌株巧妙地挑選出來(lái)

7、。3.發(fā)酵過(guò)程改良發(fā)酵過(guò)程改良 碳源、PH控制泰樂菌素的發(fā)酵以豆油為主要碳源。若分化期發(fā)酵中存在過(guò)量的葡萄糖，則促進(jìn)ATP水平的上升，從而抑制泰樂菌素的生長(zhǎng)，而豆油中的油酸、亞油酸經(jīng)過(guò)甲基化形成甲基油酸，它是泰樂菌素的前體物質(zhì)，能促進(jìn)其生物合成。 細(xì)胞內(nèi)ATP水平對(duì)抗生素生產(chǎn)的影響 細(xì)胞內(nèi)ATP水平的控制對(duì)抗生素生產(chǎn)也很重要。為進(jìn)行抗生素生物合成，必須使產(chǎn)生期中細(xì)胞內(nèi)ATP保持低水平。弗氏鏈霉菌NRRL2702生物合成泰樂菌素與細(xì)胞內(nèi)腺苷酸（ATP、ADP、AMP）濃度有關(guān)系。據(jù)研究, 在發(fā)育迅速的階段(2天)ATP及ADP的細(xì)胞內(nèi)濃度達(dá)到最高值, 然后在泰樂菌素合成剛要開始之前下降。產(chǎn)生期腺

8、苷酸總量迅速下降, 結(jié)果使泰樂菌素的生物合成受到抑制。表明ATP濃度或腺苷酸水平或此兩者都是調(diào)節(jié)泰樂菌素生物合成開始的細(xì)胞內(nèi)作用物。 油脂的作用 在脂肪水解酶的作用下分解為甘油和脂肪酸，脂肪酸通過(guò)-氧化產(chǎn)生大量乙酰CoA，為泰內(nèi)酯的合成提供大量的乙酸單位，并通過(guò)推動(dòng)TCA 循環(huán)或乙醛酸循環(huán)，由這些循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸，琥珀酰CoA在甲基丙二酰CoA羧基轉(zhuǎn)移酶和甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶的作用下形成甲基丙二酰CoA和丙酰CoA，為泰內(nèi)酯的合成提供大量的丙酸單位，從而有利于泰樂菌素的合成。PH的控制豆油含量低，不利于菌絲生長(zhǎng)，而含量過(guò)高，則不能完全利用， 產(chǎn)生脂肪酸積累, 造成PH值下降，由此可能抑

9、制了大菌素C甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，影響了組份含量。關(guān)于泰樂菌素組份轉(zhuǎn)化的機(jī)制，其關(guān)鍵酶大菌素C甲基轉(zhuǎn)移酶的活性是一促進(jìn)因素，而pH的控制對(duì)此酶的活化起著保證作用。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，主要以補(bǔ)加豆油來(lái)滿足產(chǎn)生菌對(duì)碳源的需要，而嚴(yán)格控制豆油的加量，是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。對(duì)碳源、PH的控制，可以保證發(fā)酵的產(chǎn)量。發(fā)酵過(guò)程中，pH 的變化對(duì)于預(yù)測(cè)發(fā)酵液組份具特征性指標(biāo)意義，它可以是進(jìn)行工藝設(shè)計(jì)和反饋調(diào)控的依據(jù)之一。培養(yǎng)溫度控制在泰樂菌素發(fā)酵過(guò)程中,在不同的發(fā)酵階段控制不同的最適培養(yǎng)溫度,采取變溫培養(yǎng)的方式,可以提高發(fā)酵單位,增加泰樂菌素產(chǎn)量。添加氧載體通過(guò)添加氧載體如正十二烷、全氟化碳等, 提高發(fā)酵系統(tǒng)中的氧傳

10、遞速度, 從而促進(jìn)了泰樂菌素的生物合成。當(dāng)加人5%的正十二烷或全氟化碳, 泰樂菌素的生成量分別提高14%和8%。通過(guò)加入氧載體, 改善泰樂菌素發(fā)酵系統(tǒng)的供氧能力, 以提高菌體的產(chǎn)素能力。泰樂菌素發(fā)酵是以植物油為碳源，油脂類為底物時(shí), 需消耗較多的氧，當(dāng)供氧能力提高后,可以提高產(chǎn)素能力。其原因是氧載體的加人增大了油水間的界面積, 提高了溶解氧與底物的傳遞速度, 進(jìn)而提高了菌體的產(chǎn)素能力。菌株的選育及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化 通過(guò)對(duì)泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌BMB-012進(jìn)行復(fù)壯，獲得發(fā)酵效價(jià)相對(duì)較高的菌株A-49。依次進(jìn)行紫外線氯化鋰復(fù)合誘變等多種誘變，篩選得到高產(chǎn)菌株S-22。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行了單因

11、子實(shí)驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基主要組分進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步提高泰樂菌素的發(fā)酵效價(jià)，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法的方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的菜油、魚粉D、甜菜堿鹽酸鹽、組份X這四種組份進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基使泰樂菌素的發(fā)酵效價(jià)比采用正交優(yōu)化的培養(yǎng)基SH1提高了18.3。3. 基因重組基因重組基因重組是菌種改良的另一重要途徑，手段包括：(1) 雜交育種雜交育種(2) 準(zhǔn)性重組育種準(zhǔn)性重組育種(3) 原核生物的基因重組原核生物的基因重組接合、接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等(4) 原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù) 由于原生質(zhì)體融合技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn), 為遺傳育種提供了一種有效手段,所以不論是方向性還是自覺性, 原

12、生質(zhì)體融合技術(shù)均比誘變育種前進(jìn)了一大步, 而且可以消除某一菌株在誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象。國(guó)外采用原生質(zhì)體融合及基因工程等新技術(shù)進(jìn)行育種,使菌種生產(chǎn)能力大大提高,目前發(fā)酵單位已達(dá)16000u /ml。逐步建立起來(lái)的基因工程技術(shù), 使基因或一些具有特殊功能的片段的分離變得十分容易。由于鏈霉菌是合成天然抗生素的最重要的生物, 因此基因工程育種技術(shù)在鏈霉菌中應(yīng)用最為廣泛。4.基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)泰樂菌素生物合成基因的克隆Hershberge等報(bào)道，人工合成生物合成酶的部分氨基酸序列，并以此作為探針，從組建的基因文庫(kù)中檢測(cè)抗生素合成基因，采用這種方法，克隆了泰樂菌素生物合成基因。人工構(gòu)建的生物合成基因DNA 片斷能在許多鏈霉菌中表達(dá)，產(chǎn)生泰樂菌素。分子改造與育種（提高菌種轉(zhuǎn)化泰樂菌素能力）BIB0830是將泰樂菌素轉(zhuǎn)化為乙酰異戊酰泰樂菌素(AIV)的耐熱鏈霉菌工業(yè)菌株。以pIJ8600為載體分別構(gòu)建了acyB1-B2基因整合型表達(dá)載體pBIB425。通過(guò)大腸桿菌(Escherichia coli)-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移分別將pBIB425導(dǎo)入工業(yè)菌株BIB0830,抗性篩選分別得到接合子BIB425。經(jīng)PCR驗(yàn)證均陽(yáng)性克隆。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,與出發(fā)菌株BIB0830相比,BIB425泰樂菌素轉(zhuǎn)化率提高了22%。 隨著對(duì)泰樂菌素結(jié)構(gòu)和療效研究的深入，國(guó)內(nèi)外通