生物素-親合素放大技術

1、培訓人：馬秀玲培訓人：馬秀玲概述：概述：主要內容主要內容生物素理化性質與標記生物素理化性質與標記親和素、鏈霉親和素的理化性質與標記親和素、鏈霉親和素的理化性質與標記生物素生物素-親和素的特點、基本類型及原理親和素的特點、基本類型及原理生物素生物素-親和素系統(tǒng)的應用親和素系統(tǒng)的應用 維生素維生素H H 動、植物組織中廣泛動、植物組織中廣泛 分布分布, ,卵黃和肝含量高卵黃和肝含量高MW 244.31kDMW 244.31kD羧基羧基第一部分第一部分 生物素理化性質與標記生物素理化性質與標記生物素（生物素（Biotin)有兩個環(huán)狀結構有兩個環(huán)狀結構 I環(huán)（咪唑酮環(huán)）為與親和素結合環(huán)（咪唑酮環(huán)）為與

2、親和素結合的主要部位的主要部位 II環(huán)（噻吩環(huán)）為結合抗體和其它環(huán)（噻吩環(huán)）為結合抗體和其它生物大分子的部位，生物大分子的部位，C2上戊酸側上戊酸側鏈的未端羧基是結合生物大分子鏈的未端羧基是結合生物大分子的唯一結構的唯一結構 一、活化生物素一、活化生物素 生物素側鏈的末生物素側鏈的末端端羧基羧基經(jīng)化學修經(jīng)化學修飾后制成帶各種飾后制成帶各種活性基團的衍生活性基團的衍生物物活化生物素活化生物素( (生物素化衍生物生物素化衍生物) )II環(huán)為噻吩環(huán)，其末端羧基是結合抗體和其他環(huán)為噻吩環(huán)，其末端羧基是結合抗體和其他 生物大分子的惟一結生物大分子的惟一結構，經(jīng)化學修飾后成為活化生物素構，經(jīng)化學修飾后成為

3、活化生物素生物素活化生物素活化活化生物素活化生物素易易與抗原、抗體與抗原、抗體酶及核酸分子酶及核酸分子中相應基團偶中相應基團偶聯(lián)形成聯(lián)形成生物素生物素化標記物化標記物 標記蛋白質標記蛋白質氨基氨基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質標記蛋白質醛基醛基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質標記蛋白質巰基巰基的活化生物素的活化生物素 標記標記核酸核酸的活化生物素的活化生物素 活化生物素活化生物素標記蛋白質氨基的活化生物素標記蛋白質氨基的活化生物素BNHSBNHS分子可與蛋白質賴分子可與蛋白質賴 氨酸的氨基形成肽鍵氨酸的氨基形成肽鍵 BNHSBNHS適用標記適用標記抗體抗體和和 中性或偏堿性的蛋白質中

4、性或偏堿性的蛋白質生物素生物素N-N-羥基丁二酰胺羥基丁二酰胺生物素生物素N-N-羥基丁二羥基丁二酰亞胺酯酰亞胺酯（BNHS BNHS ）生物素和生物素和N-N-羥基丁二酰亞胺之間添羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個加了兩個6-6-氨基已糖氨基已糖分子基團，形分子基團，形成連結臂，以減少位阻效應的影響成連結臂，以減少位阻效應的影響 長臂活化生物素長臂活化生物素 ( (BCNHS) BCNHS) 是在生物素和是在生物素和 N-N-羥羥基基丁二丁二酰酰亞亞胺胺之間添加了兩個之間添加了兩個 6- 6- 氨基己糖分子基氨基己糖分子基團團，形成連結臂形成連結臂， 使其與抗體、酶等生物大分子使其與抗體、酶等生物

5、大分子結合后結合后，不受位阻效應的影響不受位阻效應的影響, , 更易發(fā)揮生物素更易發(fā)揮生物素的活性作用的活性作用性糖蛋白性糖蛋白(Ag)(Ag) 標記蛋白質巰基的活化生物素標記蛋白質巰基的活化生物素馬來酰亞胺馬來酰亞胺- -丙酰丙酰- -生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)能特異地與能特異地與蛋白質巰基蛋白質巰基結合的活化生物素結合的活化生物素 標記核酸的活化生物素標記核酸的活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin) 側鏈上連接的芳香基疊氮物基團側鏈上連接的芳香基疊氮物基團, , 經(jīng)光照后經(jīng)光照后, , 變?yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結變?yōu)榉枷慊趸?/p>

6、，可直接與腺嘌呤氨基結合合, , 形成形成B B（生物素）（生物素）- -核酸核酸探針探針 生物素脫氧核苷三磷酸生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP） 作為作為TTPTTP（三磷酸胸苷）的結構類似物，可（三磷酸胸苷）的結構類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈采用缺口移位法摻入到雙鏈DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接標記核酸，可直接標記核酸，但對堿基配對有影但對堿基配對有影響（影響氫鍵的形成）響（影響氫鍵的形成）活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性對對BNHS多標記抗體多標記抗體, B

7、HZ則多標記偏酸性抗原；則多標記偏酸性抗原；抗原、抗體標記后活性不變抗原、抗體標記后活性不變可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后活性將降低后活性將降低二、二、生物素標記蛋白質生物素標記蛋白質選擇活化生物素：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記依抗原或抗體分子所帶可標記基團的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸基團的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性堿性控制生物素控制生物素: :蛋白質比例蛋白質比例 生物素生物素:IgG :IgG 用量比用量比(mg/mg)宜為宜為2:12:1 IgGIgG應用濃度應用濃度0.50.55 5g/ml 1

8、13 3個生物素個生物素/1/1個個AgAg，3 35 5個生物素個生物素/1/1個個AbAb使用使用交聯(lián)臂交聯(lián)臂減少空間阻力減少空間阻力親合素親合素(avidin, AV) 和鏈霉親合素和鏈霉親合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結合物是生物素的天然特異性結合物二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記的物質均可以同親合素（的物質均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素）或鏈酶親合素（SA）結合）結合第二部分第二部分 親合素、鏈霉親合親合素、鏈霉親合素的理化性質與標記素的理化性質與標記親和素（親和素（Avidin)耐熱并耐受多種蛋白水解

9、酶的作用，與生物素耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用，與生物素結合后穩(wěn)定性更好。每個親和素能結合四個分子的生物素結合后穩(wěn)定性更好。每個親和素能結合四個分子的生物素結構結構 四亞基糖蛋白四亞基糖蛋白 四肽鏈蛋白四肽鏈蛋白 無糖基無糖基pI 10.5 6pI 10.5 6結合位結合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 4 4 4K K（親和常數(shù)）（親和常數(shù)） 10 1015 15 10 101515活性活性(U) 13(U) 1315 1515 151818一、理一、理 化化 特特 性性二、親合素二、親合素/鏈霉親合素標記鏈霉親合素標記標記物：酶、膠體金標記物：酶、膠體金 異硫氰酸熒光素（異

10、硫氰酸熒光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良過碘酸鈉法、戊二醛法改良過碘酸鈉法、戊二醛法ABC/SABC 預制親和素預制親和素(AV)-Biotin、 鏈霉親和素鏈霉親和素(SAV)-Biotin第三部分第三部分 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的特點親合素系統(tǒng)的特點、基本類型及原理基本類型及原理一、特點一、特點: :靈敏度靈敏度特異性特異性穩(wěn)定性穩(wěn)定性適用性適用性其他其他靈敏度高靈敏度高其反應呈高度專一性其反應呈高度專一性穩(wěn)定性高穩(wěn)定性高適用范圍廣適用范圍廣實驗成本低實驗成本低二、二、生物素生物素- -親合素系統(tǒng)基本類型及原理親合素系統(tǒng)基本類型及原理BABBAB法（親和素法（親和素- -

11、標記生標記生物素法）：物素法）： 特點：以游離親和素為特點：以游離親和素為橋臂，分別連接生物橋臂，分別連接生物素化抗原（或抗體）素化抗原（或抗體）和標記生物素（如酶和標記生物素（如酶標生物素）標生物素） 返回+A+A親和素親和素-標記生物素法（標記生物素法（BAB法）：先使抗原與生物素（法）：先使抗原與生物素（B）化的抗體結合，再以游離親合素化的抗體結合，再以游離親合素(A)將生物素化的抗體與將生物素化的抗體與酶標生物素搭橋連接，也達到多層放大效果酶標生物素搭橋連接，也達到多層放大效果生物素化的抗體酶標生物素底物BABA法（標記親和素法（標記親和素- -生生物素法）物素法）特點：以標記親和素特

12、點：以標記親和素/ /標標記鏈霉親和素（記鏈霉親和素（A-A-E/SA-EE/SA-E）代替）代替BABBAB法中法中的游離親和素（的游離親和素（A A），），省卻了加標記生物素省卻了加標記生物素（B-EB-E）的步驟）的步驟BABBAB法（親和素法（親和素- -標記標記生物素法）：生物素法）： 特點：以游離親和素特點：以游離親和素為橋臂，分別連接生物為橋臂，分別連接生物素化抗原（或抗體）和素化抗原（或抗體）和標記生物素（如酶標生標記生物素（如酶標生物素）物素） +A-EBA法（標記親和素法（標記親和素-生物素法）：以標記親和素生物素法）：以標記親和素/標記標記鏈霉親和素（鏈霉親和素（A-E/

13、SA-E）代替）代替BAB法中的親和素法中的親和素（A），省卻了加標記生物素（），省卻了加標記生物素（B-E）的步驟）的步驟A-E+B-E + ABCABCABC法法特點特點: :將將BABBAB法中的法中的A（親和素）先與先與B-EB-E（酶標生物素）結合，（酶標生物素）結合，制備成復合物制備成復合物ABCABC（親和素（親和素- -生物生物素素- -過氧化酶復合物）過氧化酶復合物）ABCABC法法 原理示意圖原理示意圖特點：將特點：將BAB法中的法中的A（親和素）先與（親和素）先與B-E（酶標生（酶標生物素）結合，制備成復合物物素）結合，制備成復合物ABC+Ab-Ag-Ab-B + ABC

14、 Ab-Ag-Ab-B-ABC 預先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標生物素結合，形成可溶預先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標生物素結合，形成可溶性的性的親和素（或鏈霉親和素）親和素（或鏈霉親和素）-生物素生物素-過氧化物酶復合物（過氧化物酶復合物（ABC或或SABC）。當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，（間接法）相遇時，ABC（或（或SABC）復合物中未飽和的親和素（或鏈霉親）復合物中未飽和的親和素（或鏈霉親和素）結合部位即可與抗體上的生物素結合，使抗原和素）結合部位即可

15、與抗體上的生物素結合，使抗原-抗體反應體系與抗體反應體系與ABC（或（或SABC）標記體系連成一體進行檢測）標記體系連成一體進行檢測第四部分第四部分 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的應用親合素系統(tǒng)的應用 生物素與親合素之間結合的生物素與親合素之間結合的親合力高、親合力高、特異性強特異性強 生物素與親合素各自均可以與各型大生物素與親合素各自均可以與各型大小分子結合，以及二者在結合反應時小分子結合，以及二者在結合反應時具有的具有的多級放大作用多級放大作用等優(yōu)越性等優(yōu)越性 使使BASBAS及其相關技術被廣泛應用在各種及其相關技術被廣泛應用在各種標記免疫分析技術標記免疫分析技術領域中，尤其為標領域中，尤

16、其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻貢獻 方法應用BSABSA在酶免疫測定中的應用在酶免疫測定中的應用BSABSA在熒光免疫技術中的應用在熒光免疫技術中的應用BSABSA在放射免疫測定中的應用在放射免疫測定中的應用BSABSA在分子生物學中的應用在分子生物學中的應用BASBAS在在ELISAELISA中的應用中的應用 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定 BAB-ELISA夾心法測抗原的原理：用夾心法測抗原的原理：用替代替代常規(guī)常規(guī)ELISA中的酶標抗體，與已與固相抗體結合的抗原抗中的酶標抗體，與已與固相抗體結合的抗原抗體

17、復合物結合，然后連接親和素及酶標生物素，從而使反體復合物結合，然后連接親和素及酶標生物素，從而使反應信號放大，提高檢測靈敏度應信號放大，提高檢測靈敏度二、生物素二、生物素- -親合素系統(tǒng)在熒光免親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術中的應用疫技術中的應用BASBAS用于熒光抗體技術用于熒光抗體技術通常采用通常采用BABA法，即用熒光素直接標記親法，即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）合素（或鏈酶親合素）游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素（的生物素（BABBAB法）法）熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法抗體的夾心法 三、生物素三、生物素- -親合素系統(tǒng)在放射免親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應用疫測定中的應用BASBAS主要與免疫放射分析主要與免疫放射分析(IRMA)(IRMA)檢測體系偶檢測體系偶聯(lián)