最新DNA的損傷與修復(fù)

1、dna的損傷與修復(fù)v分子生物學(xué)作業(yè)v內(nèi)容：第五章 dna的損傷與修復(fù)v v v v v 第五章第五章 dnadna的損傷與修復(fù)的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)v1.dna1.dna損傷的產(chǎn)生損傷的產(chǎn)生v 2. 2.基因的突變基因的突變v 3.dna 3.dna損傷的修復(fù)損傷的修復(fù)v 4. 4.損傷跨越損傷跨越v 5.dna 5.dna修復(fù)缺陷與癌癥的關(guān)系修復(fù)缺陷與癌癥的關(guān)系dna的損傷與修復(fù)概況概況v 作為遺傳物質(zhì)的dna具有高度的穩(wěn)定性，但是，細胞內(nèi)外環(huán)境中各種因素依然可以造成dna的損傷。如果dna的損傷得不到有效的修復(fù)，就會造成dna分子上可遺傳的永久性結(jié)構(gòu)變化，稱為突變突變（mutati

2、on）。少數(shù)突變有可能對細胞是有利的。但絕大部分突變是有害的。v 細胞有多種形式的修復(fù)系統(tǒng)，使絕大多數(shù)損傷能夠及時修復(fù)。v 研究dna損傷與修復(fù)的機制，有兩個方面的實際意義。其一，防止dna的損傷，是預(yù)防不少疾病的有效途徑。v其二，在育種工作中，常常要誘發(fā)突變再篩選有優(yōu)良性狀的植株或微生物株系。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù) dna損傷指在內(nèi)外因素的影響下，體內(nèi)dna雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變。 若堿基的改變是兩種嘌呤或兩種嘧啶之間的互換，稱作轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換（transitions）。 若發(fā)生了嘌呤和嘧啶之間的互換，則稱作顛換顛換（transversions）。 引起dna損傷的因素很多，包括d

3、na分子本身在復(fù)制過程中發(fā)生的自發(fā)性改變，以及細胞內(nèi)各種代謝物質(zhì)和外界理化因素引起的損傷。 dna的損傷與修復(fù)5.1.1 dna5.1.1 dna分子的自發(fā)性損傷分子的自發(fā)性損傷 dna的自發(fā)性損傷可以發(fā)生在復(fù)制過程中，也可以由細胞自身產(chǎn)生的活性氧或代謝產(chǎn)物造成。根據(jù)dna損傷的狀況，和引起dna損傷的原因，可以將dna的自發(fā)性損傷分作6種類型。 dna的損傷與修復(fù)5.1.1.1 5.1.1.1 互變異構(gòu)移位互變異構(gòu)移位 互變異構(gòu)移位互變異構(gòu)移位（tautomeric shift）是堿基發(fā)生了烯醇式-酮式結(jié)構(gòu)互變，造成堿基配對發(fā)生改變，使復(fù)制后的子鏈上出現(xiàn)錯誤。生理條件下，堿基上的基團主要以酮

4、式和氨基的形式存在，但也可能發(fā)生瞬間的互變異構(gòu)，造成堿基錯配。如圖所示，若 a以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，即可與c配對，經(jīng)過dna的兩輪復(fù)制，在1/4的子代分子中，a-t對變成了g-c對。因此在dna復(fù)制時，若模板上出現(xiàn)烯醇式或亞氨基異構(gòu)體時，子鏈上就可能產(chǎn)生錯配的堿基對。 dna的損傷與修復(fù)5.1.1.2 5.1.1.2 自發(fā)脫氨基自發(fā)脫氨基vdna分子中堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，結(jié)果使c變?yōu)閡，a變?yōu)閕，g變?yōu)閤（黃嘌呤）。在dna復(fù)制時，母鏈的上述變化會在子鏈中產(chǎn)生錯誤而導(dǎo)致?lián)p傷。v a i-c，下一輪g-c，引起at gc的變；v c u-a，下一輪t-a，引起gc at的突變；v g

5、 x-c，下一輪g-c，損傷不擴大。dna的損傷與修復(fù)5.1.1.3 dna5.1.1.3 dna復(fù)制的打滑復(fù)制的打滑 在dna復(fù)制時，有時會出現(xiàn)模板鏈或新生鏈堿基的環(huán)出（looping out）現(xiàn)象，被稱作 dna聚合酶的“打滑”（slippage）。如圖所示，第一次復(fù)制時新生鏈一個或數(shù)個堿基的環(huán)出，在第二次復(fù)制時，可引起同樣數(shù)量堿基的插入。第一次復(fù)制時模板鏈一個或數(shù)個堿基的環(huán)出，在第二次復(fù)制時，可引起同樣數(shù)量堿基的缺失。這種錯誤易發(fā)生在模板上有堿基串聯(lián)重復(fù)的部位，這些部位即使發(fā)生堿基的環(huán)出，后面的堿甚配對仍然是正確的。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)5.1.1.4 5.1.1.4 活性

6、氧引起的活性氧引起的dnadna損傷損傷 活性氧指反應(yīng)活性很高的含氧自由基和h2o2，不少含氧自由基可在細胞正常代謝過程中生成。含氧自由基可造成堿基的氧化，如7, 8-二氫-8-氧鳥嘌呤（7, 8-oxog, go）就是一種氧化堿基，可與c或a配對，造成g-c t-a的顛換，dna pol i和dna pol ii的校正活性不能校正其錯配，故這種損傷可以積累。dna的損傷與修復(fù)5.1.1.5 5.1.1.5 堿基丟失堿基丟失 dna在生理條件下可通過自發(fā)性水解，使嘌呤堿和嘧啶堿從磷酸脫氧核糖骨架上脫落下來。細胞受熱或ph降低，可加劇脫嘌呤反應(yīng)，強致癌劑黃曲霉毒素b1也能加劇脫嘌呤反應(yīng)。dna的

7、損傷與修復(fù)5.1.1.6 堿基的烷基化堿基的烷基化 細胞內(nèi)一些天然的烷基化試劑，如s-腺苷甲硫氨酸，可使dna分子中的某些堿基甲基化，造成堿基錯配，經(jīng)dna復(fù)制，形成堿基對的改變。 dna的損傷與修復(fù)5.1.2 5.1.2 物理因素引起的物理因素引起的dnadna損傷損傷v dna分子容易吸收波長在260nm左右的紫外線（uv），大劑量的uv照射，可以使dna分子一條鏈上相鄰的兩個嘧啶共價結(jié)合，形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體。相鄰的兩個t或兩個c，以及c和t之間均可形成嘧啶二聚體，但最易形成的是t-t二聚體和6-4光產(chǎn)物dna的損傷與修復(fù) 電離輻射如x射線和射線等，可以引起dna的直接損傷和間接損傷。

8、dna鏈的斷裂會隨著照射劑量的增大而加劇。若dna雙鏈中只有一條鏈斷裂，稱為單鏈斷裂，若兩條鏈在同一處或緊密相鄰處同時斷裂，則為雙鏈斷裂。dna的損傷與修復(fù)5.1.3 5.1.3 化學(xué)因素引起的化學(xué)因素引起的dnadna損傷損傷v 許多天然的或合成的有機和無機化學(xué)物質(zhì)均可與dna發(fā)生反應(yīng)，改變其結(jié)構(gòu)。能誘發(fā)dna損傷的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑（mutagen），常見的化學(xué)誘變劑可以大致分為3類dna的損傷與修復(fù)5.1.3.1 5.1.3.1 堿基類似物堿基類似物v 堿基類似物（base analog）能在dna復(fù)制時取代正常堿基與模板鏈的堿基配對，從而摻人dna。 v 2-氨基嘌呤（ap

9、）是腺嘌呤的類似物，通常與胸腺嘧啶配對，以罕見的亞氨基狀態(tài)存在時，可以與胞嘧啶配對，使a-t變?yōu)間-c，相反情況下，則可將g-c變?yōu)閍-t。 dna的損傷與修復(fù)5.1.3.2 5.1.3.2 堿基的修飾劑堿基的修飾劑v某些化學(xué)物質(zhì)通過對dna分子上堿基的修飾（base modification），改變其配對性質(zhì)。例如，亞硝酸能脫去連接在堿基環(huán)上的氨基，使腺嘌呤脫氨基形成次黃嘌呤（i），后者與胞嘧啶配對，而不與胸腺嘧啶配對。胞嘧啶脫氨基后成為尿嘧啶，與腺嘌呤配對。v 羥胺（nh2oh）與dna分子上堿基的作用特異性很強，它只與胞嘧啶作用，生成4-羥胺胞嘧啶（hc），后者與腺嘌呤配對，結(jié)果使g-c

10、對變?yōu)閍-t對dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)v烷化劑（alkylating agent） 能使dna堿基上的氮原子烷基化，最常見的是鳥嘌呤第6位氮原子的烷基化，改變堿基配對性質(zhì)，如6-甲基鳥嘌呤（mg）與胸腺嘧啶配對。如果直接與配對有關(guān)的基團被烷化，則可完全阻斷復(fù)制時的堿基配對。v 較常見的烷化劑有亞硝胺化合物，包括二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺，亞硝基胍（ntg） 化合物如n, n-硝基-n-甲基亞硝基胍，亞硝基脲化合物如乙基亞硝基脲，烷基硫酸鹽化合物，包括二甲基硫酸鹽、乙基甲基硫酸鹽（ems） 和乙基乙基硫酸鹽（ees），此外，還有氮芥和硫芥等。dna的損傷與修復(fù)5.1.3.3 5.1.

11、3.3 嵌入染料嵌入染料 一些扁平的稠環(huán)分子，如吖啶橙（acridine orange）、原黃素（proflavin）、溴化乙錠（ethiduium bromide, eb）等染料，可插入到dna分子堿基對之間，故稱為嵌入染料（intercalated dye）。這些扁平分子插入dna后正好占據(jù)了一個堿基的位置，將堿基對間的距離加大約1倍，可造成dna兩條鏈的錯位。dna的損傷與修復(fù)v 細胞內(nèi)存在完善的dna損傷修復(fù)系統(tǒng)，以保障遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。不同類型的dna損傷，由不同的途徑進行修復(fù)。根據(jù)修復(fù)的機理，dna損傷的修復(fù)一般可分為直接修復(fù)、切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)、易錯修復(fù)和重組修復(fù)等。dna的

12、損傷與修復(fù)1.點突變 點突變指指dna單位分子上所發(fā)生的堿基對改變，也稱為簡單突變或單一位點突變，其最主要形式為單位分子上所發(fā)生的堿基對改變，也稱為簡單突變或單一位點突變，其最主要形式為堿基對置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種類型。有時，發(fā)生在單個位點上的少數(shù)核苷酸缺失或插入也被認堿基對置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種類型。有時，發(fā)生在單個位點上的少數(shù)核苷酸缺失或插入也被認為點突變。為點突變。 點突變帶來的后果取決于其發(fā)生點突變帶來的后果取決于其發(fā)生。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)突變的類型突變的類型5.2.1突變的類型突變的類型5.2.2突變的回復(fù)和校正突變的回復(fù)和校正5.2.3誘變劑

13、和致癌劑的檢測誘變劑和致癌劑的檢測dna的損傷與修復(fù) dna的損傷與修復(fù)錯義突變錯義突變dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)移碼突變移碼突變：在正常地dna分子中,堿基缺失或增加非3地倍數(shù),造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。例如原來的mrna是gaa、gaa、gaa、gaa按照密碼子所合成的肽鏈是一個谷氨酸的多肽。如果開頭增加一個g，那么mrna就變成了gga、aga、aga、aga按照這些密碼子合成的肽鏈就是一個一甘氨酸開頭的精氨酸的多肽。移碼突變的結(jié)果將引起該段肽鏈的改變，而肽鏈的改變將引起蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，最終引起性狀的變異。嚴重是會導(dǎo)致個體的死亡。 隱性

14、突變和顯性突變隱性突變和顯性突變隱形突變：在真核生物中，如果只發(fā)生在同源染色體其中的一條上，另一條同源染色體上正?；虻漠a(chǎn)物能夠抵消或中和突變基因?qū)毎δ艿目赡艿母淖?。如果突變發(fā)生在同源染色體上的兩個等位基因都發(fā)生突變，才能改變生物的表現(xiàn)型。顯性突變：在真核生物中有一些基因，只要同源染色體任意一個等位基因發(fā)生突變，就引起生物的表現(xiàn)型的改變。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)由于基因突變而是生物體的性狀由野生型變?yōu)橥蛔冃?，則這樣的突變稱作正向突變。正向突變?；貜?fù)突變回復(fù)突變(reverse mutation): 突變體(mutant)經(jīng)過第二次突變又完全地或部分地恢復(fù)為原來的基因型和表現(xiàn)型.

15、完全恢復(fù)是由于突變的堿基順序經(jīng)第二次突變后又變?yōu)樵瓉淼膲A基順序,故亦稱真正的回復(fù)突變.部分恢復(fù)是由于第二次突變發(fā)生在另一部位上,其結(jié)果是部分恢復(fù)原來的表現(xiàn)型.亦稱為第二位點突變(second site mutation)或基因內(nèi)校正(intragenic suppression) 校正突變校正突變：指發(fā)生在另外一個位點上，且能夠中和或抵消起始突變的第二次突變。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù) dna的損傷與修復(fù)3平板摻入試驗 將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中，需代謝活化的再加0.3ml0.4ml s9mix，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時做陰性和陽

16、性對照，每種處理做3個平行。試樣通常設(shè)4個5個劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些，有陽性或可疑陽性結(jié)果時，再在較窄的劑量范圍內(nèi)確定劑量反應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比（mr）。mr值2，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系，背景正常，則判為致突變陽性。 dna的損傷與修復(fù)5.3dna損傷的修復(fù)dna的損傷與修復(fù)5.3.15.3.1直接修復(fù)直接修復(fù)v 直接修復(fù)也稱為損傷逆轉(zhuǎn)，其修復(fù)的方式是用特定的化學(xué)反應(yīng)使受損傷的堿基恢復(fù)為正常的堿基，是最簡單、最直接的修復(fù)方式。能被這種機制修復(fù)的損傷有嘧啶二聚體、6-烷基鳥嘌呤和某些鏈的斷裂。dna的損傷與修復(fù)5.3.1.15.

17、3.1.1嘧啶二聚體的直接修復(fù)嘧啶二聚體的直接修復(fù)v 嘧啶二聚體是一種常見的dna損傷，可導(dǎo)致雙螺旋發(fā)生扭曲，而影響dna復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。嘧啶二聚體既可被直接修復(fù)，也可被切除修復(fù)。參與其直接修復(fù)的酶是dna光復(fù)活酶或光裂解酶。該酶廣泛存在于原核和真核生物的細胞中，是mr為5.51046.5104 的單體酶 ，含兩個光吸收輔因子和fadh。一旦嘧啶二聚體被直接修復(fù)，光裂解酶就與dna解離。v 光復(fù)活酶廣泛存在于細菌、真菌、果蠅、植物和很多脊椎動物中，但在哺乳動物中卻沒有這種酶，因而不能進行嘧啶二聚體的直接修復(fù)。dna的損傷與修復(fù)5.3.1.25.3.1.2烷基化堿基的直接修復(fù)烷基化堿基的直接修復(fù) v

18、 烷基化堿基的直接修復(fù)是在烷基化轉(zhuǎn)移酶的作用下完成的，e.coli中的6-烷基鳥嘌呤、4-烷基胸腺嘧啶和甲基化的磷酸二酯鍵由ada酶直接修復(fù)。ada酶以活性中心的1個cys殘基為甲基受體，但是一旦它得到甲基，酶就失活，因此是一種自殺酶，可是這個修復(fù)途徑只需一步反應(yīng)。此外，這種損傷可以由dna連接酶直接修復(fù) .dna的損傷與修復(fù)5.3.2 切除修復(fù)切除修復(fù) 切除修復(fù)切除修復(fù)（excision repair)需要先識別損傷部位，然后切除損傷的堿基或核苷酸，用正常的堿基或核苷酸填補缺口，用連接酶連接切口。 切除修復(fù)有兩種： a.堿基切除修復(fù) b. 核苷酸切除修復(fù) 兩者識別損傷的機制不同，前者是直接識

19、別具體的受損傷的堿基，后者識別的是損傷對dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲。dna的損傷與修復(fù)5.3.2.1 堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù) 堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)（base excision repair, ber） 首先作用于n-糖苷鍵，切除受損傷的堿基，比如尿嘧啶、次黃嘌呤、烷基化堿基、被氧化的堿基和其他一些被修飾的堿基等，隨后，再進行進一步的修復(fù)反應(yīng)。 ber適用范圍：較輕的堿基損傷 催化堿基切除的酶：dna糖苷酶 幾乎所有的dna糖苷酶都只作用于單個損傷堿基。不過，在t4噬菌體和黃色微球菌中發(fā)現(xiàn)了一種對嘧啶二聚體特異性的糖苷酶。 dna糖苷酶的特異性有所差別，但所有的dna糖苷酶都是沿著dna雙螺旋

20、的小溝進行掃描，發(fā)現(xiàn)受損傷的堿基后即與dna結(jié)合，并誘導(dǎo)dna結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，使損傷堿基被擠出雙螺旋，進入酶的活性中心進行切割。 dna的損傷與修復(fù)dna分子經(jīng)dna糖苷酶作用產(chǎn)生無嘌呤或無嘧啶位點（apurinic或apyridimidic site, ap位點）。該位點是細胞內(nèi)專門的ap內(nèi)切酶（ap endonuclease）的有效底物。 有兩類ap內(nèi)切酶： a. a. 5 -ap內(nèi)切酶，在ap位點的5-端切割產(chǎn)生3 -oh和5 -脫氧核糖磷酸，脫氧核糖磷酸隨后被dna脫氧核糖磷酸二酯酶 （dna deoxyribophosphodiesterase, drpase） 切除。 b b. 3

21、-ap內(nèi)切酶，它們在ap位點的3 端切開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3 -不飽和醛（unsaturated aldehydes）和 5 -脫氧核苷酸，3 -不飽和醛隨后被5 -ap內(nèi)切酶切除。 dna糖苷酶也可分作兩類,一類只有n-糖苷酶的活性，另一類除具有n-糖苷酶活性外，還有3 -ap裂解內(nèi)切酶活性（3 -ap lyase endonuclease），可作用于無嘌呤或無嘧啶位點。dna的損傷與修復(fù)在損傷部位形成切口后，可以通過兩種途徑進行修復(fù)合成。 a.短修復(fù)途徑 b.長修復(fù)途徑 兩種途徑的異同點： 1.ap內(nèi)切酶的切口都緊靠ap位點5-端的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5-脫氧核糖磷酸和3-oh。 2.短修補是主

22、要途徑，只需合成屬于ap。位點的1個正常的核苷酸；長修補時次要途徑，是前者的備用途徑，要合成1小段寡聚核苷酸。 3. 短修補用dna pol ，長修補用dna pol 或pcna。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)5.3.2.2 核苷酸切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù) 核苷酸切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, ner） 主要用來修復(fù)導(dǎo)致dna結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲并影響到dna復(fù)制的損傷，由于ner識別損傷的機制并不是針對損傷本身，而是針對損傷對dna雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的扭曲，故許多并不相同的損傷能被相同的機制和幾乎同一套修復(fù)蛋白修復(fù)。 dna的損傷與修復(fù) 盡管在真核生物

23、體內(nèi)參與ner的蛋白質(zhì)高度保守，但與原核生物的相關(guān)蛋白質(zhì)同源性卻很低。不過，原核生物和真核生物ner的基本過程是相似的，主要由5步反應(yīng)組成： 1. 由特殊的蛋白質(zhì)探測損傷，并引發(fā)一系列蛋白質(zhì)與損傷部位的有序結(jié)合。 2.由特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開dna鏈。 3. 去除2個切口之間的帶有損傷的dna片段，形成缺口。 4.由dna pol填補缺口。 5. 由dna連接酶連接切口 。dna的損傷與修復(fù)全基因組全基因組ner 和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性ner 根據(jù)識別損傷的機制和修復(fù)的范圍，可以將ner分為全基因組ner （global genome ner, ggr）和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性ner （tra

24、nscription-coupled ner, tcr）。 兩者的異同點： ggr負責修復(fù)整個基因組的dna損傷，速度慢，效率低。 tcr專門修復(fù)正在轉(zhuǎn)錄的基因模板鏈上的損傷，速度快，效率高。 兩類ner的主要差別在于識別損傷的機制上，至于損傷識別后發(fā)生的修復(fù)反映并無本質(zhì)上的區(qū)別。tcr由rna聚合酶識別損傷部位。當rna聚合酶轉(zhuǎn)錄到受損傷部位而前進受阻的時候，tcr即被起動。 dna的損傷與修復(fù)（1） 原核細胞的ner系統(tǒng) e.coli的嘧啶二聚體可以通過ggr系統(tǒng)進行修復(fù)，該系統(tǒng)需要的酶和蛋白質(zhì)如表5-1所示，其基本步驟如圖5-11所示。 2個uvra與1個uvrb形成三聚體，此過程需要水

25、解atp來提供能量。 uvra2-uvrb1復(fù)合物與dna隨機結(jié)合后受atp水解驅(qū)動，在dna分子上移動，對dna的損傷進行監(jiān)控。 一旦發(fā)現(xiàn)損傷，則uvra解離，uvrb與dna形成穩(wěn)定的復(fù)合物，接著，uvrc與uvrb-dna位點高親和性結(jié)合，誘導(dǎo)uvrb的構(gòu)象發(fā)生變化，使之在損傷部位的3-端（距離損傷點4個核苷酸）產(chǎn)生切口。隨后，uvrc催化在dna損傷部位的 5-端（距離損傷點78個核苷酸）產(chǎn)生切口，在uvrd解鏈酶的催化下，釋放一個由12 nt13 nt組成的寡聚核苷酸片段。 由dna pol i填補缺口，連接酶連接切口。dna的損傷與修復(fù)表表5-1 原核細胞原核細胞ner系統(tǒng)蛋白質(zhì)和

26、酶的功能系統(tǒng)蛋白質(zhì)和酶的功能蛋白質(zhì)功能uvra識別損傷并充當分子接頭uvrb識別損傷并在3-端切開dna鏈uvrc在損傷部位的5-端切開dna鏈uvrd解鏈酶dna poli/ii填補缺口dna連接酶連接切口dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)tcr最初是在真核細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，后來證明也存在于原核細胞。如果缺乏tcr，則dna的轉(zhuǎn)錄股與非轉(zhuǎn)錄股修復(fù)的效率應(yīng)該沒有差別。但關(guān)于e.coli乳糖操縱子dna損傷修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)物iptg存在的情況下，其轉(zhuǎn)錄股由uv誘發(fā)的損傷在5分鐘內(nèi)被全部修復(fù)，而非轉(zhuǎn)錄股的損傷，或無iptg誘導(dǎo)的細胞，其損傷約需要40分鐘才能被修復(fù)。 轉(zhuǎn)錄股更容易修復(fù)，是因為其

27、損傷更容易被識別。在e.coli的 tcr系統(tǒng)中，一旦rna聚合酶進入損傷部位，其轉(zhuǎn)錄就暫停，并形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物。mfd基因的產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄修復(fù)偶聯(lián)因子（transcription repair coupled factor, trcf）識別這種暫停的復(fù)合物，取代rna聚合酶，同時將uvra2-uvrb1復(fù)合物招募到損傷部位，并促進uvra與uvrb解離，從而加快uvrb-dna預(yù)剪切復(fù)合物的形成。隨后損傷被切除，以及填補缺口和連接切口的反應(yīng)與ggr完全相同（圖5-12）。dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)（2） 真核細胞的ner系統(tǒng) （2） 真核細胞的ner系統(tǒng) 真核細胞的ner系統(tǒng)大概需要

28、30多種蛋白質(zhì)參與，但是，修復(fù)的基本原理和過程與原核細胞非常相似。 與原核細胞的ner模型相似，真核細胞的ner涉及多個步驟，雖然各種蛋白質(zhì)結(jié)合的次序還存有一定的爭議，哺乳動物ggr系統(tǒng)的基本步驟是比較明確的。 dna的損傷與修復(fù) xpc和hr23b形成二聚體，識別并結(jié)合到dna的傷部位，使雙螺旋的扭曲加劇。 tfiih, rpa和xpa與雙螺旋嚴重扭曲的損傷部位結(jié)合，形成約20bp30bp的單鏈區(qū)域，rpa作為ssb與已解開的單鏈區(qū)域結(jié)合。 xpg和xpf/erccl作為對dna結(jié)構(gòu)特異性的內(nèi)切酶，被招募到已解鏈的損傷部位， xpb/xpd的解鏈酶活性協(xié)助2個切點之間包含損傷部位的寡聚核苷酸

29、(平均長度為27 nt)脫離復(fù)合物。 dna po1或與pcna一起進行修補合成，填補缺口。最后，連接酶連接切口。 哺乳動物tcr系統(tǒng)識別損傷的機制與ggr系統(tǒng)不同，首先，rna聚合酶ii延伸復(fù)合物暫停在損傷部位，并導(dǎo)致一小部分區(qū)域發(fā)生解鏈。隨后，csa和csb被招募到rna聚合酶上，進而協(xié)助招募tfiih, xpa , rpa和xpg到損傷部位，rna聚合酶、rna轉(zhuǎn)錄物、csa和csb則解離下來，于是形成了與ggr一樣的復(fù)合物，后續(xù)的步驟與ggr系統(tǒng)完全相同(圖5-13)。 dna的損傷與修復(fù)dna的損傷與修復(fù)5.3.35.3.3錯配修復(fù)錯配修復(fù)v 錯配修復(fù)（mmr）系統(tǒng)主要用來糾正dna

30、雙螺旋上錯配的堿基對，此外，還能修復(fù)一些因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。 此途徑的缺陷可產(chǎn)生所謂的突變子表型，表現(xiàn)為細胞的自發(fā)突變率和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性增高。v mmr的過程與其他切除修復(fù)途徑相似，但與其他修復(fù)系統(tǒng)不同的是mmr系統(tǒng)需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯誤的核苷酸，而不會切除母鏈中本來就正確的核苷酸 dna的損傷與修復(fù)v e.coli的mmr長修補途徑需要多種蛋白質(zhì)，muts負責識別錯配的堿基對，識別效率取決于錯配堿基對的類型和所處的環(huán)境。此外，長修補途徑還需要特殊的核酸外切酶，dna pol和dna連接酶。v其mmr作用的主要步驟如下： 1)muts識別并結(jié)合錯配

31、的堿基對，或因堿基插入或缺失在dna上形成的小環(huán)，mutl隨后結(jié)合。 2)muth與gatc位點結(jié)合，在錯配堿基對兩側(cè)的dna通過muts做相向移動，形成雙鏈突環(huán)。 3）mutha的核酸內(nèi)切酶活性被 muts/mutl激活，切割非甲基化子鏈的gatc的5-端。dna的損傷與修復(fù) 4）uvrd作為解鏈酶，催化唄切開的含有錯配堿基的子鏈與母鏈分離。 5）dna pol和連接酶分別填補缺口和連接切口。錯配修復(fù)是一個高耗能的過程。v e.coli還有另外兩條不需要muts,mutl和 muth的短修補mmr途徑：.依賴于muty的修復(fù)途徑，用于取代a-g和 a-c錯配堿基對中的a。.極短修補途徑，用于

32、糾正g-t錯配堿基對中的t。v 在哺乳動物細胞中，也存在一種類似的短修補mm途徑，用來糾正其甲基化的cpg島上因脫氨基產(chǎn)生的g-t錯配堿基對上的t。 dna的損傷與修復(fù)5.3.45.3.4雙鏈斷裂的修復(fù)雙鏈斷裂的修復(fù)vdna斷裂特別是雙鏈斷裂時一種極為嚴重的損傷，這種損傷難以徹底修復(fù)。v雙鏈斷裂修復(fù)主要有兩種機制：其一是同源重組，精確性高；其二為非同源末端連接，能在無同源序列的情況下，讓斷裂的末端重新連接起來，這種方式精確性低，但卻是人類修復(fù)雙鏈斷裂的主要方式。dna的損傷與修復(fù)vnhej是dsbr中最簡單和最常用的一種方式，其基本步驟如下 : 1）2個ku70/k80異源二聚體與2個dna斷

33、裂末端結(jié)合。 2）dna-pkcs與artemis蛋白形成合物，被ku70/k80招募到dna末端，并使斷裂的dna相互靠近。 3）dna-pkcs 與dna末端結(jié)合后，其蛋白質(zhì)既沒的活性被激活，使artemis蛋白磷酸化。 4）artemis蛋白被磷酸化后，其核酸酶活性被激活，可水解末端突出的單鏈區(qū)域，創(chuàng)造出連接酶的有效底物。 5）xrcc4和連接酶共同催化已加工好的dna末端之間的連接 dna的損傷與修復(fù)5.4 損傷跨越dna的損傷與修復(fù)v損傷跨越（damage bypass）：dna復(fù)制過 程中發(fā)生的損傷，無法修復(fù)時，在暫 時保留損傷的情況下，繼續(xù)復(fù)制，復(fù) 制結(jié)束后再進行修復(fù)，由于這一機

34、制 是事先合成錯誤率較高的dna，再對 其進行修復(fù)，故也可被稱作易錯修復(fù)。v特點：保留損傷，先復(fù)制，再修復(fù)。dna的損傷與修復(fù)5.4.1 5.4.1 重組跨越重組跨越v重組跨越重組跨越( (recombinational bypass)又稱為重組修復(fù)重組修復(fù)(recombination repair），其基本機制是通過對 dna模板的交換，跨越模板鏈上的損傷部位，在新合成的鏈上恢復(fù)正常的核苷酸序列。重組跨越雖然沒有消除模板鏈上損傷，但也沒有在復(fù)制過程中擴大損傷。模板鏈上的損傷可以在復(fù)制完成后，用其它途徑進行修復(fù)。dna的損傷與修復(fù)e.colie.coli重組跨越的兩種機制：重組跨越的兩種機制：

35、 第一種： 在新鏈合成遇到損傷部位時，通過蛋白質(zhì)reca, recf, reco和 recr的作用，使復(fù)制叉后退，兩條新合成的鏈回折，形成互補雙鏈。接著，因模板鏈上的損傷而中斷合成的新鏈，以另一條新鏈為模板，在dna pol i的催化下進行鏈的延伸，隨后，復(fù)制叉向前移動，跨越損傷部位，進行正常的復(fù)制。如圖517 dna的損傷與修復(fù)v 第二種：一旦復(fù)制叉到達損傷位點如嘧啶二聚體，或模板鏈斷裂，dna pol 即停止移動并與模板鏈解離，另一條模板鏈在reca, recf, reco和 recr的作用下斷裂，并與受損傷的模板鏈形成互補雙鏈，在跨越損傷部位后繼續(xù)合成新鏈，然后在ruva, ruvb和

36、ruvc的作用下，鏈的交叉部位遷移，在斷裂的模板鏈上留下的一段缺口，由dna pol i和連接酶修補。其后，dna復(fù)制可按正常機制完成。這一機制形成鏈交叉，以及交叉點的遷移，是十分復(fù)雜的過程。如圖5-17dna的損傷與修復(fù)5.4.2 5.4.2 合成跨越合成跨越合成跨越（bypass synthesis):在模板鏈遇到損傷部位，負責復(fù)制的dna pol (原核細胞是dna pol ，真核細胞是聚核酶或)停滯不前的情況下，用可以進行跨膜合成的dna pol取代復(fù)制酶，在損傷部位的互補位置上隨機插入(正確的或錯誤的) 核苷酸，合成錯配率較高的dna ，再用其他機制進行修復(fù)。dna的損傷與修復(fù)v（1）大腸桿菌的跨越合成u sos反應(yīng)：指細胞受到潛在致死性壓力，為了生存所啟動的一系列生理生化反應(yīng)。包括易錯的dna跨越合成，細胞絲狀化（細胞伸長但不分